前列腺癌组织中miRNA-34c、c-Met mRNA的表达观察

朱志义，窦中岭

(1河南科技大学临床医学院，河南洛阳 471003；2河南科技大学第一附属医院)

前列腺癌是常见的男性泌尿系统恶性肿瘤，发病率居男性恶性肿瘤第一位[1]。2000～2011年，我国前列腺癌发病率及病死率持续增长，2015年我国前列腺癌发病率为60.3/10万例、病死率26.6/10万例[2]，严重影响男性健康。近年来前列腺癌诊断和治疗水平得到极大提高，但确切病因及发病机制尚不清楚，晚期转移性前列腺癌患者病死率较高[3]。微小RNA(miRNA)是一段内源性、非编码、18～25个核苷酸的RNA序列，可通过结合mRNA的3′UTR，诱导mRNA降解或抑制mRNA的翻译发挥作用，影响细胞分化、增殖、侵袭和凋亡等过程。多种miRNA的异常表达与前列腺癌的发生发展相关，miR-34家族包括miR-34a、miR-34b及miR-34c,miR-34c基因位于11q23,其在结肠癌、喉癌等肿瘤组织中miR-34c表达下调[4～7]。编码受体酪氨酸激酶的肝细胞生长因子受体(c-Met)是较早鉴定的原癌基因，肝细胞生长因子(HGF)是其主要配体，c-Met/HGF在不同组织具有不同的生物学功能，与器官再生、肿瘤形成过程中促进细胞有丝分裂有关[8]。在胶质细胞瘤、黑素瘤、结肠直肠癌、乳腺癌等许多肿瘤组织中均存在c-Met过度表达现象，与肿瘤浸润、转移及不良预后有关，抑制c-Met表达是一种新的肿瘤治疗方式[9]。近年前列腺癌组织中c-Met表达情况研究结果尚不一致。本研究观察了前列腺癌组织中miR-34c、c-Met mRNA的表达情况，分析其与前列腺癌临床病理参数、预后的关系，并探讨两者在前列腺癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2011年9月～2013年9月河南科技大学第一附属医院收治的前列腺癌患者63例，年龄55～78(67.54±7.80)岁；术中获取前列腺癌组织标本，术后均经病理检查确诊。根据Gleason评分系统进行病理分级，参照《中国泌尿外科疾病诊断治疗指南》推荐的标准[10]分组如下：Gleason评分≤6分29例、Gleason评分≥7分34例；参照2002年美国癌症联合会前列腺癌TNM分期Ⅰ～Ⅱ期27例、Ⅲ～Ⅳ期36例；前列腺癌患者初始血清前列腺特异抗原(PSA)8.3～131 ng/mL,平均35.6 ng/mL，其中≤10 ng/mL者11例、10～20 ng/mL者33例、>20 ng/mL者19例；均检测血清碱性磷酸酶、X线、MRI、核素骨扫描等检查后明确远处转移14例、无转移49例。前列腺癌患者术后随访2～60个月，平均47.7个月，以门诊或电子通讯方式，定期进行直肠指检、血清PSA、B超及MRI等检查，随访至2018年9月30日或患者死亡。另选同期因前列腺增生接受耻骨上前列腺摘除术的患者45例，年龄58～80(66.57±7.12)岁;术中获取的组织标本,术后均经病理检查确诊。两组患者均为初次诊断，术前均未接受其他治疗，并排除其他恶性肿瘤。组织经液氮速冻后，-80 ℃冰箱保存备用。本研究经河南科技大学第一附属医院医学伦理委员会批准通过，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 组织miR-34c、c-Met mRNA检测方法 采用实时荧光定量PCR法。TRIzol法提取细胞中总RNA。以3 μL总RNA为模板，用TaqMan逆转录试剂盒在ABI prism 7500荧光定量PCR仪上进行逆转录合成cDNA，反应条件：16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。miR-34c特异性茎环引物：5′-CGCGAGGCAGTGTAGTTAGCT-3′，5′-AGTGCAGGG-TCCGAGGTATT-3′；内参基因U6:5′-GCTTCGGCAG-CACATATACTAAAAT-3′，:5′-CGCTTCACGAATTTG-CGTGTCAT-3′，c-Met:5′-TGAAATTCATCCAACCAA-ATCTT-3′,5′-AATAGAAAACTGACAATGTTGAGAG-G-3′。实时荧光定量PCR反应总反应体系20 μL中，含1 μL cDNA、1 μL 引物对、8 μL Power SYBR Green Master Mix试剂、10 μL不含RNase去离子纯水，反应条件：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s,60 ℃、30 s，40个循环。所有反应均在ABI 7500PCR仪上完成，每个样本重复3次。用2-ΔΔCt表示受检组织中miRNA-34c、c-Met mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 前列腺癌组织、前列腺增生组织中miR-34c、c-Met mRNA相对表达量比较 前列腺癌组织、前列腺增生组织中miR-34c相对表达量分别为0.521±0.426、1.247±0.681，c-Met mRNA的相对表达量分别为2.527±0.348、1.056±0.217，两者比较，P均<0.05。前列腺癌组织、前列腺增生组织中miR-34c相对表达量分别为0.521±0.426、1.247±0.681，c-Met mRNA的相对表达量分别为2.527±0.348、1.056±0.217，两者比较，P均<0.05。

2.2 前列腺癌组织miR-34c、c-Met mRNA表达的相关性 前列腺癌组织miR-34c、c-Met mRNA表达呈负相关(r=-0.630，P=0.002)。

2.3 miR-34c、c-Met mRNA表达与前列腺癌临床病理参数的关系 结果见表1。

表1 miR-34c、c-Met mRNA表达与前列腺癌临床病理参数的关系

注：由表1可知miR-34c表达与前列腺癌患者Gleason评分和TNM分期有关(P均<0.05)，c-Met mRNA表达与前列腺癌患者Gleason评分、TNM分期及有无远处转移有关(P均<0.05)。

2.4 miR-34c、c-Met mRNA表达与前列腺癌患者预后的关系 以前列腺癌组织中miR-34c、c-Met mRNA相对表达量的中位数为界，分别将63例前列腺癌患者分为miR-34c高表达者33例与miR-34c低表达者30例、c-Met mRNA高表达者35例与c-Met mRNA低表达者28例。miR-34c高表达者3、5年 总体生存率(OS)分别为84.85%(28/33)、60.61%(22/33)，miR-34c低表达者分别为70.00%(21/30)、40.00%(13/30)，分析表明miR-34c高表达者3、5年 OS均显著高于低表达者(χ2分别为5.387、7.627，P均<0.05)；前列腺癌患者中c-Met mRNA高表达者3、5年 OS分别为68.51%(24/35)、37.14%(13/35)，c-Met mRNA低表达者分别为89.29%(25/28)、78.57%(22/28)，分析表明c-Met mRNA高表达者3、5年 OS显著低于c-Met mRNA低表达者(χ2分别为5.808、9.807，P均<0.05)。

3 讨论

前列腺癌是常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，近年发病率有逐渐增加的趋势[1]。近年来随着分子遗传学和肿瘤的发生发展机制研究的深入，出现许多新的诊断治疗方法及药物，如基因治疗、免疫治疗等，改善患者生存质量，延长患者生存时间。但目前对晚期前列腺癌、激素抵抗性前列腺癌等，目前临床仍无有效的治疗方案。因此有必要深入研究前列腺癌的分子机制，寻找新的诊断治疗靶点。miRNA广泛存在于真核细胞中，作为内源性非编码RNA，其前体在Dicer酶加工后形成具有茎环二级结构，结合于mRNA的3′非编码区，影响mRNA的稳定性，影响基因的转录。目前大量研究表明[5,7]，miRNA通过影响癌基因及抑癌基因的表达，调控肿瘤的发生发展过程，影响肿瘤细胞增殖、凋亡、血管生成、亲润转移等恶性生物学过程。研究[11]表明，miRNA参与多条细胞信号传导通路的调节，如TGF-β传导通路、雄激素受体传导通路等，与前列腺癌细胞增殖、凋亡、转移等恶性生物学行为密切相关。在结肠癌、非小细胞肺癌和肝细胞癌等19种肿瘤中均存在miR-34异常表达下调的现象。本研究中，前列腺癌组织中miR-34c的相对表达量明显低于前列腺增生组织，表明前列腺癌组织中miR-34c表达下调，与以往研究[12]结果一致。其机制可能与miR-34c基因位点11q23杂合性缺失有关，也可能与表观遗传学修饰后miR-34c基因失活有关[13]。本研究中Gleason评分≥7分前列腺癌患者癌组织miR-34c表达量低于评分≤6分者，Ⅲ～Ⅳ期前列腺癌患者癌组织miR-34c表达量低于Ⅰ～Ⅱ期者，表明miR-34c的表达与肿瘤较高的TNM分期、病理分级有关。其机制可能是miR-34的表达受转录因子p53的调节，p53基因的突变或缺失多发生于高级别、进展期前列腺癌中[14]，p53基因突变导致miR-34表达下降，因而在低级别、早期局限性前列腺癌中miR-34表达下降不明显。本研究中miR-34c高表达组患者3、5年 OS显著高于miR-34c低表达者，表明miR-34c高表达者患者与miR-34c低表达者患者相比预后较好，可能与miR-34c的抑癌作用有关。

c-Met是一种原癌基因，位于7q31上，其能编码190 KD的跨膜糖蛋白，近年研究[15]发现，发现前列腺癌组织c-Met mRNA高表达与高Gleason评分密切相关。本研究结果表明，前列腺癌组织中c-Met的表达量明显高于前列腺增生组织，表明前列腺癌组织中c-Met mRNA表达上调，其机制可能与c-Met原癌基因扩增有关，也可能与缺氧导致HIF1α升高，进而诱导c-Met基因表达增加有关[16]。本研究中Gleason评分≥7分前列腺癌患者癌组织c-Met表达量高于评分≤6分者，Ⅲ～Ⅳ期前列腺癌患者癌组织c-Met mRNA表达量高于Ⅰ～Ⅱ期者，有远处转移前列腺癌患者癌组织c-Met mRNA表达显著高于无远处转移者，表明c-Met mRNA表达与肿瘤较高的分期及病理分级有关，并且与肿瘤远处转移有关。其机制可能与前列腺癌细胞c-Met/HGF过度活化后，激活PI3K/ERK通路，下调E-钙黏素表达，并诱导细胞发生上皮间质转化，使肿瘤细胞获得局部浸润和远处转移的能力[17]。本研究中c-Met高表达者3、5年 OS显著低于c-Met低表达者，表明c-Met高表达提示患者的不良预后，可能与c-Met高表达患者分期、分级较高有关。

有研究[18]表明鼻咽癌、胃肠癌、肺癌中miR-34c能够下调c-Met基因表达，进而影响肿瘤细胞增殖、侵袭转移及凋亡。本研究中，对前列腺癌组织中miR-34c与c-Met mRNA表达的相关性进行分析，结果表明二者呈负相关，提示二者可相互作用，共同促进前列腺癌的发生发展。其相互作用的机制可能是c-Met表达活化PI3K/AKT/mTOR通路，mdm2表达增加进而抑制p53蛋白功能[19，20]，p53基因激活促进miR-34c表达，miR-34c进而靶向抑制c-Met基因表达，从而形成一条反馈环路。