RSPO2过表达人肝星状细胞株LX-2中差异表达蛋白的筛选及生物学功能分析

殷新光，薛文英，徐英，吴一鸣，袁芳，邹丹丹

(1嘉兴学院附属妇女儿童医院，浙江嘉兴 314000；2嘉兴学院附属第一医院；3杭州佰辰医学检验所有限公司)

RSPO蛋白家族由4个同源蛋白组成，共享60%的序列同源性且结构域相似，广泛参与生物体的生长发育及各项生命活动[1]。已知RSPO可通过刺激富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体(LGR)4、LGR5、LGR6来增强Wnt信号传导[2]，Wnt信号传导与肝纤维化及众多癌症密切相关[3,4]。此外，CCl4诱导的肝纤维化小鼠中RSPO2表达显著高于正常小鼠；同时RSPO2在人类纤维化肝组织中过表达，而在正常肝组织中多检测不到[1]，但是关于RSPO2在肝纤维化发病过程中所起作用尚不明确。肝星状细胞作为肝脏非实质细胞之一，其激活和增生是肝纤维化发生、进展的中心环节[5]。随着对肝纤维化研究的不断深入，以肝星状细胞为切入点探索肝纤维化治疗的新方法逐渐引起人们的兴趣。本研究在前期研究RSPO2过表达会影响肝纤维化的基础上[1]，以人肝星状细胞作为研究对象，通过蛋白组学手段分析RSPO2过表达肝星状细胞LX-2与正常LX-2细胞间的差异表达蛋白，筛选出差异表达蛋白，为进一步研究肝纤维化发病机理、过程，以及RSPO2蛋白在肝纤维化过程中所起的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂、仪器 LX-2细胞购自上海纪宁实业有限公司；293T cDNA、pcDNA3.1(-)购自上海康颜生物科技有限公司，RPM1640培养基和胎牛血清、胰蛋白酶购自Sigma-Aldrich公司，高保真聚合酶、T4 DNA 连接酶购自Toyobo公司，胶回收试剂盒购自Axygen公司；PCR仪、凝胶成像分析仪购自Bio-Rad公司；Q-Exactive质谱仪、液相色谱仪Easy nLC 1000购自Thermo公司，RNeasy Mini kit购于Qiangen公司。

1.2 RSPO2过表达载体构建 氨基酸序列为1-243的全长-人源RSPO2基因(GeneID：340419，NM_178565.4)以293T细胞的cDNA为模板经PCR纯化所得，其PCR引物设计在5′和3′末端分别引入限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点。正向和反向引物序列如下：CCACACTGGACTAGTGGATCCATGCAGTTTCG-CCTTTTCTC和CAGCGGTTTAAACTTAAGCTTTTATTGGTTGCTCTGTCTG。纯化后的PCR产物经凝胶电泳图判定符合预期的核酸片断大小，并将它与具有相同酶切的质粒pcDNA3.1(-)连接成功后转入Top10感受态，重组质粒测序验证正确。

1.3 LX-2细胞复苏传代及RSPO2过表达载体转染、鉴定 LX-2细胞置于完全培养基(含10%FBS和双抗的RPMI1640培养基)，37 ℃，5%CO2条件下进行培养。复苏后的细胞依据其生长状态进行传代，一般汇合程度约达90%。取细胞以5×105接种于6孔板中，加入无双抗的完全培养基，当细胞生长到70%～80%汇合时转染。具体转染步骤：100 μL无血清的RPMI1640培养基中分别加入重组质粒1 200 ng，Attractene Transfection Reagent转染试剂4.5 μL，轻轻混匀。室温孵育10 min后，用含双抗的完全培养液换液，37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养。过表达判定：培养板接种细胞之前先用标记笔在6孔板背面画横线标记。将转染RSPO2重组质粒的LX-2设为实验组，消化后接入6孔板，细胞铺满板底，用1 mL枪头垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板3次，洗去划痕产生的细胞碎片，加入无血清RPMI1640培养基，0、12 h取出拍照，并根据收集图片数据分析实验结果。对照组细胞迁移距离为(38.8±4.3)μm，实验组为(69.0±6.1)μm，两组比较，P<0.05，说明LX-2细胞中成功地过表达了RSPO2基因。再利用RNeasy Mini kit抽提实验组和对照组总RNA，以管家基因β-actin作为内参，对细胞总RNA进行均一化处理，利用循环阈值(Ct值)的变化计算RSPO2基因的相对表达量。对照组RSPO2 mRNA表达水平为2.050 96E-05±8.629 88E-07，实验组为0.015 279±0.000 472，两组比较，P<0.05。

1.4 RSPO2过表达的肝星状细胞LX-2和正常LX-2细胞差异表达蛋白筛选 将实验组与对照细胞放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养，48 h后收集两组细胞，PBS洗3次，通过溶液内酶解的方式制备细胞全蛋白样本[6]，使用LC-MS/MS对细胞酶解液进行蛋白组学分析。质谱数据采集采用数据依赖模式(DDA)，选取强度最高的10个母离子通过HCD碰撞打碎(NCE：30%)，分别获得二组谱图。质谱采集参数为：正离子模式；毛细管电压：2.1 kV；一级质量范围Mass Range：300～1 500，分辨率70000 @m/z 200；二级分辨率17 500 @ m/z 200；启用AGC，target value 2E5；母离子选择质量窗口1.6 m/z。原始文件(raw)用Max Quant 1.5.2.8分析数据[7]，并用Maxquant自带算法鉴定多肽及蛋白质，并给出相对定量信息[8]。搜库参数：可变修饰Variable modification： Oxidation(M)，Acetyl(Protein N-term)；固定修饰：Fixed modifications： Carbamidomethyl(C)。搜索使用的数据库为uniprot.human.fasta(201607)，protein sequence items：92607。结果过滤参数：peptide FDR≤0.05；protein FDR≤0.05。

1.5 差异表达蛋白的生物信息学分析 对上述质谱结果进行进一步分析，首先删除缺失值超过60%的蛋白，再利用R语言的KNN算法对数据中的缺失值进行补充，以组间表达差异>1.2(上调)或<0.8(下调), 且P<0.05(student′st-test)为显著差异标准筛选差异表达蛋白。利用生物信息学在线数据库DAVID 6.8对筛选出的差异表达蛋白质进行功能注释分析(GO)，得到RSPO2过表达人肝星状细胞和正常人肝星状细胞分别在生物过程、细胞成分和分子功能上富集的GO Term。

2 结果

2.1 RSPO2过表达LX-2细胞和正常LX-2细胞的蛋白表达质谱 对RSPO2过表达LX-2细胞与正常LX-2细胞分别进行3次LC-MS分析，得到6个raw data数据，共鉴定到2 423种蛋白。大多数被鉴定到的蛋白所含肽段数<10种，且蛋白数量随着匹配的肽段数的增加主要呈现逐渐减少的趋势。

2.2 RSPO2过表达LX-2细胞与正常LX-2细胞的差异表达蛋白 通过差异表达分析共获得233个差异表达蛋白。与正常LX-2细胞比较，RSPO2过表达LX-2细胞中表达下调的蛋白有115个，表达上调的蛋白有118个(P<0.05)，详见表1，表1中只列出了差异较为显著的15个高表达蛋白和15个低表达的蛋白，其中SEC62[9]、PCMT1[10]、S100A11等基因已被报道与肝癌密切相关，其他蛋白因差异不明显且报道文章较少，故表中未列出。

2.3 RSPO2过表达LX-2细胞差异表达蛋白的功能 利用David软件对115个低表达蛋白和118个高表达蛋白进行GO注释分析。这些生物学过程主要包括核转录mRNA分解代谢过程，无义介导衰变(校正P值7.62E-07)，翻译起始(校正P值1.71E-06)，翻译(校正P值7.27E-06)，RNA剪接(校正P值8.50E-06)，mRNA加工(校正P值7.59E-05)等，这些富集到的过程大多与RNA的转录与翻译过程有关，主要分泌到细胞外，位于细胞膜、细胞质、溶酶体等位置，主要参与poly(A)RNA结合、RNA结合、核苷酸结合、核糖体结构成分等过程。

3 讨论

肝星状细胞作为肝脏非实质细胞之一，其持续激活是肝纤维化发生发展过程中的关键环节。激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高，这两类变化最终奠定了肝纤维化、门静脉高压症发病的病理学基础。随着对肝纤维化研究的不断深入，以肝星状细胞为切入点探索肝纤维化治疗的新方法逐渐引起人们的兴趣。

表1 RDPO2高表达人肝星状细胞LX-2中差异表达蛋白

注：0.00*表示该蛋白在RSPO2过表达星状细胞中不表达而在对照组中表达；∞*表示该蛋白在RSPO2过表达星状细胞中表达而在对照组中不表达。

RSPOs蛋白家族均为分泌性蛋白，可通过激活并协同Wnt/β-catenin信号通路参与对细胞增殖和分化的调控，在肠癌、食管癌等多种疾病的发生发展过程中起到不可忽视的作用[11]。研究[12,13]发现，在人纤维化肝组织、肝纤维化小鼠模型中、特定的肝癌细胞系中均观察到R-Spondin2的过表达。

本研究选择人肝星状细胞构建RSPO2过表达细胞系，通过划痕实验确定RSPO2过表达的LX-2细胞12 h内迁移率明显大于对照组，表明在LX-2细胞中成功地过表达了RSPO2蛋白。随后，研究RSPO2过表达LX-2细胞与正常LX-2细胞蛋白组学谱，获得候选差异表达蛋白质共计233个，其中115个蛋白质在RSPO2过表达细胞中表达下调，118个表达上调，这些差异表达蛋白参与了很多与细胞转录、复制、增殖相关的信号通路。

在表达上调的蛋白中，S100钙结合蛋白A11(S100A11)是S100蛋白家族中的一员，与钙结合后蛋白构象发生改变再与靶蛋白结合，其主要功能是转导钙依赖性的细胞调节信号，参与细胞增殖、分化、凋亡、炎症发生等多种生命过程。研究[14]表明，在人角蛋白细胞内，S100A11与肿瘤密切相关TGF-β/Smads通路有关。当胞外钙离子和TGF-β浓度上升时，S100A11被PKCa磷酸化并转移至细胞核，联合TGF-β信号转导分子Smads，通过激活Sp1/Sp3诱导p21/WAF1抑制DNA合成，以表现出生长抑制作用[15]。Smad-S100A11介导的通路可转导高浓度TGF-β触发的生长抑制信号，即抑制S100A11蛋白活性可达到抑制TGF-β传导的细胞生长的信号。这一研究在人肝癌、人宫颈癌细胞中已被证实。

PCMT1也被称为PIMT，是一种修复酶，能促使自发形成的异构化的天冬氨酸残基转化成正常构型。Dong等[16]发现，PCMT1蛋白表达与临床分期，肌层浸润，淋巴结转移和远处转移明显相关，生存分析显示，PCMT1蛋白高表达是膀胱癌患者独立的不利预后因素。体外实验表明，PCMT1通过调节上皮-间质转化(EMT)相关基因表达调控膀胱癌细胞的迁移和侵袭，但对增殖没有影响。

异源三聚体Sec61复合物和二聚体Sec62/Sec63复合物位于人内质网膜中，在新合成的前体肽易位到内质网中起到重要的作用，此外，SEC基因的突变、扩增和过表达与各种疾病相关，包括肾脏和肝脏疾病，糖尿病和癌症。多篇研究表明了SEC62作为头颈癌、前列腺癌和肺癌的预后和预测生物标志物的相关性[9,17]。

在表达下调的蛋白中，TET2蛋白是一种渐进保守的加双氧酶，属于TET家族3个成员之一，在去甲基化过程中将5-甲基胞嘧啶氧化为5-羟甲基胞嘧啶，从而在表观遗传水平上调控基因的表达[18]。研究发现，TET2在骨髓增殖性肿瘤[19]和骨髓增生异常综合征[20]患者中存在突变，在骨髓增生异常综合征中的突变率高达25%～30%。TET2的突变包括基因的缺失、插入、移码突变等，并伴随5-羟甲基胞嘧啶的总量的显著减少[21]。

AIMPs家族有AIMP1、AIMP2、AIMP3三个亚型蛋。AIMP2也被称为p38/JTV-1蛋白,是AIMPs家族三个亚型之一，参与了多种生物学功能，如细胞分化和凋亡等[22]。AIMP2是一种潜在的肿瘤抑制因子，AIMP2的剪接突变体AIMP2-DX2(缺少外显子Exon2)与AIMP2竞争性结合目标蛋白，抑制了AIMP2的抗肿瘤活性，表现为促癌因子。抑制AIMP2-DX2可明显抑制肿瘤细胞这一现象表明了AIMP2-DX2有可能成为潜在的癌症新靶点。因此，AIMP2-DX2也成为目前研究的热点[22～24]。Yum等[25]在小鼠模型中研究了肠内稳态和肿瘤发生的AIMP2和Wnt/β-catenin信号传导之间的关系，并发现AIMP2能结合到Wnt/β-catenin信号通路重要的组成成分DVL上，从而抑制了DVL与AXIN的相互作用，此外AIMP2是通过以Aimp2基因剂量依赖性方式抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导来抑制肠类器官的形成和生长，低表达的AIMP2可能降低了对Wnt/β-连环蛋白信号的抑制作用，从而导致细胞的代谢异常。与正常LX-2组比较，过表达RSPO2的LX-2蛋白组AIMP2表达显著降低。

总之，通过蛋白组学方法筛选出与肝脏相关疾病的差异表达蛋白，可能作为潜在的生物学靶点，并为RSPO2介导的肝纤维化过程的研究提供了更多的研究资料。目前的工作还需后续相关工作进一步鉴定和验证。