高活性纤维素酶食用菌菌种筛选

徐 源，崔继鹏，武秋颖，范永山



高活性纤维素酶食用菌菌种筛选

徐 源，崔继鹏，武秋颖，范永山

（唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000）

利用刚果红染色法对生产中常见的6个食用菌菌种进行高活性纤维素酶菌株筛选，通过方差分析和α=0.01水平上的DuncanS-N-K均数间两两比较，发现鸡腿菇的产纤维素酶能力显著优于其他菌种。培养72 h时的鸡腿菇51的纤维素酶活力最高，达到33 U·μL-1，72 h后产酶能力逐渐下降。

纤维素酶；刚果红；酶活力；食用菌

食用菌，是一类能形成大型肉质（或胶质）子实体或菌核类组织并能供人们食用或药用的大型真菌。食用菌没有叶绿素，依靠降解培养物来提供自身生长所需的营养物质。因此，大型真菌的酶资源异常丰富，依靠它产生的纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶，能分解一般动植物不能利用的纤维素，半纤维素和木质素[1-3]。食用菌品种众多，不同品种产酶组分和能力各有不同。因此，筛选产酶能力强的高活性纤维素酶食用菌迫切而重要。

本文以6个生产中常见的平菇[4]、鸡腿菇[5]和茶树菇[6]菌种为试验材料筛选高活性纤维素酶菌种，为进一步分离纯化高活性纤维素酶及其生产应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

平菇（平原生3、黑嘉丽、何氏200、绣针菇71）、鸡腿菇51和茶树菇TS1，均由唐山市农业科学院刘海英研究员提供。

1.2 培养基制备

PDA培养基：去皮土豆200 g、蔗糖20 g、琼脂18 g、水1 000 mL。自然pH下，121 ℃高压灭菌30 min。

固体筛选培养基：CMC-Na 2.0 g、NaCl 0.5 g、(NH4)2SO42.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、琼脂18 g、水1 000 mL。自然pH下，121 ℃高压灭菌30 min。

液体发酵产酶培养基：CMC-Na 2.0 g、NaCl 0.5 g、(NH4)2SO42.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、水1 000 mL。自然pH下，121 ℃高压灭菌30 min。

1.3 菌株活化及培养方法

将保存在PDA试管斜面培养基中的菌种在无菌环境下转接至PDA平板培养基中央，28 ℃倒置培养5 d，至菌丝布满培养皿。用直径0.8 cm的打孔器沿同一菌落直径打孔，用接种铲挑取菌盘，将菌盘转接至固体筛选培养基平板中央，28 ℃倒置培养6-7 d，至菌落直径达5 cm左右。再次打菌盘转接至固体筛选培养基平板中央，28 ℃倒置培养3 d，待测。

将筛选出的菌种，转接至装有5 mL液体发酵产酶培养基的15 mL离心管中，每支离心管接3个菌盘，菌盘直径0.8 cm，于28 ℃、180 rpm条件下，分别培养72 h、96 h和120 h。

1.4 刚果红染色法筛选产酶菌株

向待测平皿内加入10 mL 1.5 mg/mL刚果红染色液，静置染色20 min，然后用0.9% NaCl溶液冲洗浸泡脱色[7]。选择透明圈明显，边界清晰的平皿，分别测量透明圈直径（）和菌落直径（），以透明圈直径和菌落直径的比值（/）大小作为筛选的标准[8]。

每组试验重复3次，用SPSS软件对实验数据进行方差分析。

1.5 纤维素酶活力检测

配制浓度为1.0 mg/mL的标准葡萄糖溶液，分别取出0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至6支15 mL具塞试管中，分别加入2.0 mL的DNS试剂摇匀，沸水浴10 min，水浴结束后立即冷却，加蒸馏水定容至10 mL。用分光光度计测定540 nm处吸光度值，用Excel绘制葡萄糖标准曲线，得到回归方程为：

= 1.179 3- 0.0.015 5（2= 0.998 4）。

将产酶培养发酵液于4 ℃，4 000 rpm，离心10 min，上清液即为粗酶液。取粗酶液1.0 mL，加入1% CMC-Na溶液1.0 mL，50 ℃水浴30 min，然后加入2.0 mL DNS试剂，沸水浴10 min，水浴结束立即冷却，加蒸馏水定容至10 mL，混匀。用沸水浴10 min灭活的粗酶液作对照，测定540 nm处吸光度值，绘制葡萄糖标准曲线计算葡萄糖含量，根据酶活计算公式计算酶活。

酶活定义为：1.0 mL酶液、1.0 min催化纤维素生成1.0 µmol葡萄糖为1个酶活单位，以U·mL-1表示，计算公式为：

式中，表示粗酶液的稀释倍数；5.56为还原糖的摩尔系数；表示由吸光度从标准曲线上查得的葡萄糖浓度；表示酶解反应之后试管内溶液体积；表示反应时间；1表示所加酶液体积。

2 结果与分析

2.1 刚果红染色法筛选试验

将6个食用菌菌种在产酶筛选培养基平板上培养3 d后，刚果红染色试验结果如图1所示。由图可见，6个菌种均产生明显的浅黄色透明圈，且边界清晰。

图1 刚果红染色实验结果

对试验菌种测量D/d，结果如表1所示。对纤维素降解能力最强的是鸡腿菇71，其次为平菇各品种，降解能力最弱的菌种是茶树菇TS1。对初筛的D/d进行方差分析和α=0.01水平上的Duncan S-N-K均数间两两比较，结果表明鸡腿菇与其他菌株间差异极其显著。

表1 刚果红染色筛选测定D/d结果

2.2 纤维素酶活性检测

对鸡腿菇51进行液体培养，测定内切纤维素酶活力，结果如图2所示。

在28 ℃，180 rpm、自然pH值条件下，培养72 h时，鸡腿菇51产纤维素酶活力最高，达到33 U/µL，之后随着培养时间的延长，纤维素酶活力逐渐下降。与72h相比，发酵时间为96h时，纤维素酶活性下降了46%，到120h时，纤维素酶活性下降了79%。

图2 不同培养时间鸡腿菇产纤维素酶活力测定

3 结论

通过对6种常用的平菇、鸡腿菇和茶树菇菌种进行纤维素活性检测和产酶能力分析，发现鸡腿菇51的纤维素活性和产酶能力显著高于供试的平菇和茶树菇菌种。

[1] 黄年来.中国食用菌百科[M].北京:农业出版社,1993: 100-101.

[2] Carmen Sánchez. Lignocellulosic residues: Biodegra- dation and bioconversion by fungi[J]. Biotechnology Advances, 2009, 27(2): 185-194.

[3] 赵国萍,李迎秋.纤维素酶的研究进展及其在食品工业的应用[J].山东食品发酵,2015,45(2):37-40.

[4] 李文香,王士奎,樊铭聪,等.3种不同贮藏方式对平菇保鲜品质的影响[J].中国食用菌,2014,33(2): 53-56.

[5] 陈军,王雨净,夏志华.几种珍稀食用菌菌种纤维素酶系组分活性的比较[J].上海师范大学学报(自然科学版), 2006,5(6):76-80.

[6] 徐静娟,王树英,贡小清,等.茶树菇提取物的组分分析[J].食品工业科技,2006, 27(12): 165-167.

[7] 崔丽红,李积华,吴浩.筛选产纤维素酶丝状真菌的刚果红法之比较[J].广东化工,2015,42(1) 30-31,36.

[8] 陆晨,陈介南,王义强,等.一株产纤维素酶真菌的筛选及产酶条件优化[J].中南林业科技大学学报,2012, 32(6):118-127.

Screening of Edible Mushrooms with High Cellulase Activity

XU Yuan, CUI Ji-peng, WU Qiu-ying, FAN Yong-shan

(Department of Life Science, Tangshan Normal University, Tangshan 063000, China)

The high-cellulase-activity strains were screened by Congo red staining method from 6 common varieties of edible fungi, and the analysis of variance and the average number of Duncan S-N-K on the level of alpha=0.01 were compared. The results showed that the cellulase-producing ability ofwas significantly better than that of other strains, followed byand. The cellulase activity ofcame to the climax of 33 IU/L after 72 hours of liquid cultivation, then the enzyme production ability gradually decreased with the extension of culture time.

cellulase; Congo red; enzyme activity; edible fungi

S646

A

1009-9115(2019)03-0064-03

10.3969/j.issn.1009-9115.2019.03.018

唐山市科技计划项目（17120204a），唐山师范学院科技发展项目（2017C03、2016C05）

2018-07-19

2018-12-04

徐源（1994-），女，吉林白山人，本科生，研究方向为生物技术。

（责任编辑、校对：李春香）