基于种特异性COI标记的花生蚜快速鉴定技术

鞠 倩曲明静杜 龙薛 明梁景华许婷婷*姜晓静*

(1.山东省花生研究所,山东 青岛 266100; 2.山东农业大学植物保护学院,山东 泰安 271018;3.漳州市英格尔农业科技有限公司,福建 漳州 363000)

花生蚜(AphiscraccivoraKoch),属昆虫纲同翅目蚜科蚜属。花生蚜为多食性害虫,除了对花生有极大的危害外,还可以对苜蓿、苕子、豌豆、豇豆等200多种寄主植物造成危害[1]。在我国大部分地区都有危害发生,其中山东、河南、河北地区为花生蚜的重灾区。花生蚜通常以成、若蚜群集在花生的嫩芽、嫩叶、花柄及果针等处为害,常导致叶片卷缩、变黄,植株生长缓慢,果针无法下针,进一步影响荚果发育。而且它还是花生病毒的传播媒介[2-3]。据中国农村农业部数据显示,2000-2014年间,每年全国花生蚜发生面积达到1797.24万亩次,每年由花生蚜虫造成全国范围内的花生减产达28,735.81 t[4]。

因此,花生蚜虫的快速准确识别是对其进行有效防控的首要前提。目前国际上用于花生蚜虫鉴定的方法主要是通过形态特征来确定种类。但花生蚜虫虫体仅1.5～2.0 mm,且花生田或其他为害田有其他形态特征极其类似的过境、非为害蚜虫干扰其鉴定。因此,传统的形态学鉴定法难以满足田间对花生蚜进行快速准确识别的需求,建立一套快速准确的花生蚜分子检测技术势在必行。

本研究采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I (mitochondrial DNA cytochrome coxidase subunit I, mtDNA COI)基因的种特异(species-specific COI)PCR技术[5],研究建立花生蚜的快速检测技术体系,对花生蚜虫发生的及时预测预报和有效防控具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 田间取样及试虫鉴定

本研究中所使用的蚜虫类害虫均采自山东省花生研究所试验站。所有节肢动物、线虫、软体动物样本浸泡于无水乙醇(分析纯,99.7%),-20℃保存备用。所有生境节肢动物、线虫、软体动物的形态鉴定由南京农业大学王备新教授和西北农林科技大学杨兆福教授协助完成。

1.2 花生田蚜虫类害虫及其他节肢动物、线虫、软体动物样本基因组的单头提取

使用改进的试剂盒法提取基因组。首先用无水乙醇洗净样本,擦干乙醇后将样本与适量小钢珠放入2mL研磨管中,用球磨仪将样本打碎,将样品转移至1.5mL离心管中。向离心管中加入250μL Buffer IL和20μL Proteinase K,振荡或颠倒使样品混匀。将混匀后的离心管放入恒温水浴锅中55℃水浴6h或过夜消化样品,水浴消化期间需偶尔将样品颠倒混匀。样品被消化完全后,13000×g离心3min,转移上清液至新的1.5mL离心管中。向离心管中的消化液加入500μL Buffer IL(加一倍乙醇稀释),涡旋混匀30s。把HiPure gDNA Micro Column 装在2mL收集管中,将混合液和沉淀一起转移至柱子中,10000×g离心30～60 s。加入600μL Buffer GW1至柱子中,10000×g离心30～60 s。加入600μL Buffer GW2至柱子中。10000×g离心30～60 s。重复上述操作1次,13000×g离心3min。将柱子装在新的1.5mL离心管中。加入15～30μL预热至55℃的Elution Buffer或Buffer TE至柱子的膜中央。放置2min,13000×g离心1min。然后置于-20℃保存备用。

表1 用于种特异性检测的花生蚜虫COI基因引物 [4]Table 1 Species-specific COI primers [4]

表2 用于花生蚜虫COI基因引物种特异性检测的86个物种 [4]Table 2 Families (86 nontarget taxa, replicates and treatments for a total of 162) [4]tested for cross-reactivity against primer pairs

1.3 COI基因5'端序列的扩增

以花生田蚜虫类害虫及其他节肢动物、线虫、软体动物样本基因组为模板,采用mtDNA COI基因通用型引物F-LCO-1490(5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3')与R-HCO-700ME(5'-TCAGGGTGACCAAAAAATCA-3')[6]

进行PCR扩增。PCR反应体系25μL,其中模板DNA 0.5μL,5×Buffer(含Mg2+)5μL,dNTPs(2.5 mmol/L) 2μL,上游引物和下游引物(10μmol/L)各0.5μL,TaqDNA聚 合 酶(2.5U/μL) 0.2μL,ddH2O补加至25μL。PCR反应条件为:94℃预变性3min; 98℃ 10s,55℃ 5s,72℃ 20s,35个循环;72℃延伸10 min。取 6μL PCR扩增产物,加1μL 6×上样缓冲液,以 DNA Marker DL2000 为参照,在含有GoldView(0.5μg/mL)的2%的琼脂糖凝胶上电泳。检测成功的样品送上海生物工程技术服务有限公司测序。

1.4 花生蚜虫特异性引物的设计及种特异性检测

根据测序结果设计六对花生蚜虫特异性引物(表1),以花生蚜虫为阳性对照,以在同一花生田采集的、与花生蚜同生境的节肢动物、线虫、软体动物样本DNA为模板检验六对引物的种特异性。PCR反应体系25μL,其中模板DNA 0.5μL,5×Buffer(含Mg2+(5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL, 上游引物和下游引物(10μmol/L)各0.5μL,Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.2μL,ddH2O补加至25μL。 PCR反应条件:94℃预变性3 min;98℃10s,55℃5 s,72℃20 s,35 个循环;72℃延伸10min。扩增产物的电泳检测方法同1.3。

图1 mtDNA COI基因通用型引物F-LCO-1490/R-HCO-700ME对花生田蚜虫类害虫基因组的扩增效果Fig.1 PCR amplification of mitochondrial DNA of aphids in peanut field using COI gene universal primers F-LCO-1490/R-HCO-700ME

图2 引物AC_F3/ AC_R2在与花生蚜同生境节肢动物、线虫、软体动物样本中的扩增效果Fig.2 Amplification pattern of mitochondrial DNA of peanut aphid and other species in peanut field using AC_F3/ AC_R3 primers

图3 引物AC_F4/ AC_R4在与花生蚜同生境节肢动物、线虫、软体动物样本中的扩增效果Fig.3 Amplification pattern of mitochondrial DNA of peanut aphid and other species in peanut field using AC_F4/ AC_R4 primers

图4 引物AC_F5/ AC_R5在与花生蚜同生境节肢动物、线虫、软体动物样本中的扩增效果Fig.4 Amplification pattern of mitochondrial DNA of peanut aphid and other species in peanut field using AC_F5/ AC_R5 primers

图5 引物AC_F6/ AC_R5在与花生蚜同生境节肢动物、线虫、软体动物样本中的扩增效果Fig.5 Amplification pattern of mitochondrial DNA of peanut aphid and other species in peanut field using AC_F6/ AC_R5 primersM： DNA marker (DL2000);

图6 引物AC_F7/ AC_R7在与花生蚜同生境节肢动物、线虫、软体动物样本中的扩增效果Fig.6 Amplification pattern of mitochondrial DNA of peanut aphid and other species in peanut field using AC_F7/ AC_R7 primers

2 结果与分析

2.1 花生田蚜虫类害虫COI基因5'端序列的扩增

电泳结果显示,两种蚜虫类害虫均能扩增出一条清晰的靶标片段(图1)。双向测序经电泳检测验证合格的PCR产物,确定此类蚜虫为花生蚜虫,该片段长度为1450bp。

2.2 花生蚜虫COI基因引物的设计及种特异性和灵敏性检测

电泳检测结果显示,该六对特异性引物均有扩增能力,片段大小见表1。以在同一花生田采集且与花生蚜同生境的节肢动物门(86个物种,162个检测样本,见表2)、线虫(1个物种,2个检测样本)、软体动物(1个物种,2个检测样本),共166个样本DNA为模板,以设计的六对引物进行PCR扩增,同时以花生蚜虫基因组为阳性对照。

电泳结果显示,引物AC_F2/AC_R2可在花生蚜虫基因组中扩增出条带,片段长度299bp。但此对引物在与花生蚜同生境的节肢动物、线虫、软体动物样本中均未扩增出条带。其他五对引物均可在多种不同物种中扩增出条带 (图2～图6)。

3 讨论与结论

Hebert 等[7]利用mtDNA COI基因中的一段序列对生物物种类别进行分子鉴定,并将这种技术命名为DNA条形码技术(DNA barcoding),此技术可通过对昆虫特定基因片段的测序及对比而准确确定其分类地位。针对个体较小、通过形态鉴定困难的昆虫种类,目前DNA 条形码技术是有效而准确的分子鉴定手段[8]。

多拷贝的mtDNA COI基因,因其母系遗传、分子量小、进化速度快等特点,被认为能准确对物种进行鉴别[9]。 同时,COI基因这一序列相对保守,易被通用引物扩增。本研究利用节肢动物mtDNA COI通用引物F-LCO-1490与R-HCO-700ME, 对花生田蚜虫类害虫基因组进行了扩增,确定了青岛地区花生蚜的mtDNA COI基因序列。并根据此序列,设计多对特异引物,以在同一花生田采集的、与花生蚜同生境的节肢动物、线虫、软体动物样本基因组为模板,对引物的种特异性进行了检测,确定了花生蚜的种特异性引物序列。上述结果表明,种特异性引物AC_F2/AC_R2对其他物种不具有交叉反应扩增能力,可用于花生蚜虫的种类鉴定,这对田间花生蚜发生预测预报及本地天敌对花生蚜捕食作用的检测具有重要意义。

需要说明的是,为了节约试验投入成本及试验时间,除引物AC_F2/AC_R2之外的其他五对特异引物,在以与花生蚜同生境节肢动物、线虫、软体动物样本中的PCR扩增试验中,当出现可以扩增到条带的样本时,便认为此引物不具备种特异性,不再继续其他种类样本的引物种特异性验证试验。