黄骅虾酱的微生物学和理化性质研究

吴小禾，耿晓杰，张建旭，桑亚新，孙纪录，*

（1.中山火炬职业技术学院生物医药系，广东 中山 528436；2.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001）

虾酱是一种在东亚和东南亚地区流行的传统调味品，由虾盐腌发酵而成[1-2]。传统发酵食品不仅具有较高的营养价值和独特的风味，还含有很多生理活性成分[3]。但是，许多传统发酵食品是在作坊或家庭内进行加工[4]。它们主要采用天然发酵，受外部环境等条件的影响，其品质不稳定，还可能存在一定的安全性问题，例如，菌落总数超标，高盐环境、发酵过程产生的生物胺[5-7]，挥发性盐基氮，丙二醛和亚硝酸盐等。

虾酱发酵过程中，产生微生物学的和生物化学的变化。其中，蛋白质水解是虾酱发酵期间发生的一种重要的生化反应。它由虾中内源性蛋白酶以及在高盐条件下存活的嗜盐细菌产生的蛋白酶引起。蛋白质水解引发低分子量化合物的形成，如，肽、氨基酸和胺类，发酵过程中也会产生有害的代谢产物，从而影响发酵产品的质地和风味[2]。另外，腐胺的增加和盐厌氧菌属的增长有关[8]。所以，自然发酵产品的微生物菌群在产品感官、品质中起着重要的作用。

生物胺作为人体的正常活性成分可促进生长和代谢，增强肠道系统免疫活性，并在神经系统中发挥作用[9]；但是，高浓度的生物胺将造成人体神经系统和心血管系统损伤[10]。食品中的生物胺主要由氨基酸经脱羧酶类催化的脱羧反应产生，最常见的生物胺是组胺、腐胺、尸胺、亚精胺和精胺[11]。生物胺可以作为食品和含酒精饮料的质量和新鲜度的指标[12]。但是，由于大部分生物胺没有荧光和紫外发色基团，因此需经衍生化后才能测量[9]。本研究采用丹磺酰氯柱前衍生的高效液相色谱方法测定黄骅虾酱的生物胺含量。

在每个国家或地区，制作虾酱的原料、发酵温度、盐浓度、pH 值和加工过程往往不同[13]，因此，每种虾酱可能具有不同的名称、颜色、理化特性、感官特性以及功能特性。本研究旨在对黄骅虾酱的微生物学和理化特性进行系统分析，以评价黄骅虾酱的安全性，并为其传统发酵方法的改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虾酱：5 种，购自黄骅海园市场（家庭自制，3 种，分别编号为XJ1、XJ2、XJ3）和黄骅耀华商厦（工场生产，2种，分别编号为 XJ4、XJ5）。

伊红美蓝琼脂、平板计数琼脂（plate count agar，PCA）、孟加拉红琼脂和乳酸细菌液体（De Man，Rogosa and sharpe，MRS）琼脂培养基：北京索莱宝科技有限公司。

硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）：国药集团化学试剂有限公司；乙腈，色谱纯：福晨（天津）化学试剂有限公司；1，1，3，3-四乙氧基丙烷（丙二醛乙缩醛）、标准品（组胺二盐酸盐，纯度≥99%；酪胺盐酸，纯度≥98%；2-苯乙胺，纯度 ≥ 98 %；色胺，纯度≥ 98 %；尸胺二盐酸盐，纯度≥98%；腐胺，纯度≥98%；精胺，纯度≥97%；亚精胺，纯度≥98%）、衍生剂（丹磺酰氯，纯度≥99%）：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters Breeze 高效液相色谱仪：沃特世公司；3-18K 型高速冷冻离心机：Sigma 公司；FA-stlab 水分活度测定仪：法国GBX 公司；DTD 超声波清洗机：宁波新制生物科技股份有限公司；LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；HD-850 桌上式洁净工作台：苏州净化设备有限公司；DHP-500 电热恒温培养箱：上海科恒实业发展有限公司；PHS pH 计：合肥桥斯仪器设备有限公司；721G 可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；XHF-DY 高速分散器：山东博科生物产业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 虾酱的微生物学分析

购买虾酱样品之后，立刻进行虾酱的微生物学分析[7]。在试管中，将1 g 样品和9 mL 无菌生理盐水混合，震荡2 min，充分混匀，制成10-1稀释度的菌悬液；然后，吸取1 mL 10-1菌悬液于9 mL 无菌生理盐水中，制成10-2菌悬液，充分混匀；依次作10 倍逐级稀释，制成10-3、10-4菌悬液；通过倾注平板法进行微生物计数分析。PCA 培养基用于菌落总数测定；孟加拉红琼脂培养基用于计数酵母菌和霉菌；伊红美蓝琼脂培养基用于计数致病性肠杆菌[1]；含有 10%NaCl（pH 7.5）的PCA 用于计数嗜盐细菌；含有1%CaCO3和10%NaCl（pH 7.5）的MRS 琼脂培养基用于计数乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB），计数具有透明圈的菌落；含有10%NaCl 和1%酪蛋白酸钠（pH 7.5）的PCA 用于计数水解蛋白的细菌，计数具有透明圈的菌落[2]。对于酵母菌和霉菌，在30 ℃培养5 d；对于所有嗜温性细菌和致病性肠杆菌，在37 ℃培养2 d；嗜盐细菌、乳酸菌和水解蛋白的细菌，在37 ℃培养5 d。菌落计数结果报告为每克样品的菌落形成单位（colony forming units，CFU）的对数（lg CFU/g）[1]。所有的平板计数进行平行试验并做空白对照以确保准确性。

1.3.2 虾酱的理化性质分析

1.3.2.1 pH 值测定

在试管中，将2 g 虾酱和10 mL 蒸馏水混合，振荡 2 min，充分混匀，室温（25 ℃）静置 5 min，取出上清液，测定样品的pH 值，每种样品测定3 次以确保准确性[14]。

1.3.2.2 盐分测定

采用直接滴定法（GB/T 5009.39-2003《酱油卫生标准的分析方法》）。

1.3.2.3 水分含量测定

采用直接干燥法（GB 5009.3-2016《食品安全国家标食品中水分的测定》）。

1.3.2.4 水分活度测定

采用水分活度仪扩散法（GB 5009.238-2016《食品安全国家标食品中水分活度的测定》）。

1.3.2.5 丙二醛含量测定

采用分光光度法（GB 5009.181-2016《食品安全国家标食品中丙二醛的测定》）。

1.3.2.6 亚硝酸盐含量测定

采用分光光度法（GB 5009.33-2016《食品安全国家标食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》）。

1.3.2.7 挥发性盐基氮测定

采用自动凯氏定氮法（GB 5009.228-2016《食品安全国家标食品中挥发性盐基氮的测定》）。

1.3.2.8 生物胺含量的测定

采用高效液相色谱法（GB 5009.208-2016《食品安全国家标食品中生物胺的测定》）。

1）生物胺标准溶液的配制。

2）样品处理：准确称取虾酱样品2.5 g，置于50 mL离心管中；加入25 mL 0.1 mol/L HCl，混匀；在高速分散器内16 000 r/min 均质1 min；然后，在20 ℃条件下，在离心机内6 500 r/min 离心30 min；过滤[7]。

3）生物胺的衍生：取1 mL 标准溶液/滤液于10 mL离心管内；加入 200 μL 2 mol/L NaOH、300 μL 饱和NaCO3、1 mL 丹磺酰氯（10 mg/mL 丙酮溶解），黑暗中，40 ℃水浴 45 min；加入 100 μL 氨水，避光反应 30 min；最后，用乙腈定容到5 mL。用滤膜（0.22 μm）将上述样品过滤至进样瓶，供液相色谱检测[7]。

4）高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC） 条件：WondaSil C18色谱柱：5 μm，4.6 mm×250 mm，Tokyo，Japan；流速：0.8 mL/min；柱温：40 ℃；波长：254 nm；进样量：20 μL；流动相：流动相 A为0.1%的乙酸铵，流动相B 为乙腈；梯度洗脱程序：0.01 min～10 min，35 %；10 min～15 min，20 %；15 min～30 min，10%；30 min～35 min，35%[15]。

2 结果与分析

2.1 黄骅虾酱的微生物学分析

2.1.1 虾酱的菌落总数分析

黄骅虾酱中的菌落总数情况见图1。

图1 黄骅虾酱中的菌落总数Fig.1 Aerobic bacterial count in Huanghua shrimp paste

菌落总数是食品安全的一个重要标准。由图1 可知，在5 种受试样品中，只有家庭自制的XJ3 中菌落总数（5.40 lg CFU/g）大于食品安全标准规定的水产调味剂中菌落总数（5 lg CFU/g）；其它4 种虾酱均合格，XJ1、XJ2、XJ4 和 XJ5 中菌落总数分别为 2.81、2.91、0.92、2.44 lg CFU/g，总体来看，工厂生产的虾酱中的菌落总数低于家庭自制的虾酱。

2.1.2 虾酱的嗜盐性细菌数量分析

黄骅虾酱中的嗜盐性细菌数量情况见图2。

图2 黄骅虾酱中的嗜盐性细菌数Fig.2 Halophilic bacteria count in Huanghua shrimp paste

虾酱属于高盐食品。由图2 可知，5 种受试虾酱中均含有一定数量的嗜盐性细菌，其中，家庭自制的XJ3中嗜盐性细菌数量最多（6.28 lgCFU/g），其它4 种虾酱XJ1、XJ2、XJ4 和 XJ5 中的嗜盐性细菌数量分别为1.78、3.04、2.78、1.89 lgCFU/g。Pongsetkul J 等的研究结果揭示，Kapi 虾酱中的主要微生物也是嗜盐性细菌[2]。有研究表明，恒温发酵虾加工副产物，在高盐度下，只有耐盐/嗜盐性细菌生长，有效地抑制了腐败菌，发酵的产品更美味[13]。

2.1.3 虾酱的酵母菌和霉菌数量分析

黄骅虾酱中的酵母菌和霉菌数量情况见图3。

由图3 可知，受试黄骅虾酱样品中真菌数量较少，仅在家庭自制的XJ1 和XJ3 中检出了真菌，数量分别为0.50 lg CFU/g 和1.66 lg CFU/g，而在其它3 种虾酱中，没有真菌检出。Cheok C Y 等的研究表明，辣椒虾酱中的真菌数也较少，为2.43 lg CFU/g[1]。

图3 黄骅虾酱中酵母菌和霉菌数Fig.3 Yeast and mold counts in Huanghua shrimp paste

2.1.4 虾酱的致病性肠杆菌数量分析

黄骅虾酱中的致病性肠杆菌数量情况见图4。

图4 黄骅虾酱中致病性肠杆菌数Fig.4 Pathogenic enterobacteriaceae count in Huanghua shrimp paste

由图4 可知，在5 种受试的虾酱样品中，除了工厂生产的XJ4，其它4 种都有致病性肠杆菌的检出，XJ1、XJ2、XJ3 和 XJ5 中的致病性肠杆菌数分别为 1.29、0.63、2.28 lgCFU/g 和 0.50 lgCFU/g，家庭自制的 XJ3 中数量最高。总体来看，工厂生产的虾酱中，致病性肠杆菌数量少于家庭自制虾酱。

2.1.5 虾酱的分解蛋白质的细菌和乳酸菌数量分析

在受试的5 种虾酱样品中，均未检出乳酸菌和分解蛋白质的细菌。这可能由于样品为终产品，盐度较高不利于这些微生物的长期存活。在以后的试验中，可以采用宏基因组测序技术[16]，对虾酱进行微生物多样性分析，以更好地了解虾酱各个发酵时期的微生物区系组成，分析虾酱的生物安全性与微生物菌群之间的关系[17]。

2.2 黄骅虾酱的理化性质分析

2.2.1 虾酱的一般理化指标分析

黄骅虾酱的一般理化指标情况见表1。

由表1 可以看出，5 种受试虾酱中的食盐含量都低于国家安全标准（25%），均为合格。谢主兰等[18]的研究表明，食盐添加量为15%～18%的低盐虾酱，也具有较好的防腐作用，并利于风味物质的形成，保持高品质特征。受试虾酱的pH 值均在7.0～8.0 之间，可能是由于蛋白质过度水解，产生生物胺等碱性物质，从而使pH 值升高[19]。各虾酱样品的水分活度均在0.70～0.90之间，对一般细菌的生长有抑制作用。根据水产行业标准，虾酱中水分含量应≤60%。因此，受试虾酱的水分含量整体偏高，只有工厂生产的XJ5 在该项目达标。

表1 黄骅虾酱的一般理化指标Table 1 General physicochemical indicators of Huanghua shrimp paste

2.2.2 虾酱的丙二醛含量分析

黄骅虾酱中的丙二醛测定和含量情况分别如图5和图6所示。

图5 丙二醛标准曲线Fig.5 Malonaldehyde standard curve

图6 黄骅虾酱中丙二醛的含量Fig.6 Malondialdehyde content in Huanghua shrimp paste

丙二醛含量是衡量油脂氧化程度的一个重要指标。在油脂的国家标准中，丙二醛含量≤0.25 mg/kg，对于虾酱中的丙二醛，目前尚无适用标准。由图6 可知，家庭自制与工厂生产的虾酱中都含有丙二醛，XJ1、XJ2、XJ3、XJ4 和 XJ5 中的含量分别为 4.53、0.80、1.55、0.14、0.94 mg/kg，其中家庭自制的 XJ1 含量最高，工厂生产的XJ4 含量最低。整体而言，相对于工厂生产的虾酱，家庭自制虾酱内丙二醛含量更高。

2.2.3 虾酱的亚硝酸盐含量分析

黄骅虾酱中的亚硝酸盐测定和含量情况分别如图7 和图8所示。

图7 亚硝酸钠标准曲线Fig.7 Sodium nitrite standard curve

图8 黄骅虾酱中的亚硝酸盐含量Fig.8 Nitrite content in Huanghua shrimp paste

由图8 可知，5 种受试虾酱样品 XJ1、XJ2、XJ3、XJ4和 XJ5 中的亚硝酸盐含量分别为 0.18、0.31、0.29、0.24、0.48 mg/kg，远远小于我国食品安全标准（30 mg/kg），因此，受试黄骅虾酱不存在亚硝酸盐超标的问题。

2.2.4 虾酱的挥发性盐基氮含量分析

黄骅虾酱中的挥发性盐基氮含量情况如图9所示。

图9 黄骅虾酱中的挥发性盐基氮含量Fig.9 Volatile base nitrogen content in Huanghua shrimp paste

挥发性盐基氮是动物性食品中蛋白质分解腐败变质的一个重要指标。在绿色食品标准中，我国农业部对其规定的限量是≤150 mg/100 g；对于虾酱，目前尚无明确的适用标准。从图9 可知，5 种受试虾酱样品XJ1、XJ2、XJ3、XJ4、XJ5 中挥发性盐基氮含量分别为167、400、401、271、208 mg/100 g。因此，虾酱中挥发性盐基氮的含量还有待降低，以使其更加安全。

2.2.5 虾酱的生物胺含量分析

黄骅虾酱中的生物胺含量情况如表2所示。

表2 黄骅虾酱中的生物胺含量Table 2 The content of bovine serum albumin in Huanghua shrimp paste

美国食品和药品监督管理局标准规定，除水产品外，其他食品中组胺含量应＜50 mg/kg，生物胺总量应≤1 000 mg/kg。欧盟规定，除水产品以外，其他食品（包括肉制品）中组胺含量应≤100 mg/kg，酪胺含量应限制在 100 mg/kg～800 mg/kg，β-苯乙胺含量应＜30 mg/kg。荷兰乳品协会推荐，肉制品中组胺含量应限定在100 mg/kg～200 mg/kg。我国目前只限定了鲜、冻动物性水产品中组胺的含量，仅上海市制定了DB 31/2004-2012《食品安全地方标准发酵肉制品》，其中规定组胺含量应≤100 mg/kg[20]。从表2 可以看出，5 种受试虾酱样品中均含有一定量的生物胺；色胺只在家庭自制的XJ3 中检出，含量为24 mg/kg；精胺、亚精胺和组胺在5种虾酱中均未检出；除了XJ1，在其它4 种虾酱中，均检出了苯乙胺；在家庭自制的XJ2 和工厂生产的XJ5中，检出了腐胺，含量分别为445 mg/kg 和13 mg/kg；在家庭自制的XJ1、XJ3 和工厂生产的XJ5 中，检出了尸胺，含量分别为1、391、152 mg/kg；仅在家庭自制的XJ1 和XJ2 中，检出了酪胺。总体来说，家庭自制的黄骅虾酱中生物胺含量较高。

3 结论

在受试黄骅虾酱的微生物学特征方面，大多数样品菌落总数合格，数量在3 lgCFU/g 以下；所有样品中均存在嗜盐性细菌；样品中酵母菌和霉菌数量较低，数量在2 lgCFU/g 以下，且在多数样品中未检出；大多数样品中检出了致病性肠杆菌，数量在3.16 lgCFU/g以下；所有样品中未检测到乳酸菌和分解蛋白质的细菌。在受试黄骅虾酱的理化特征方面，所有样品的食盐含量合格；pH 值在7.0～8.0 之间；水分活度在0.70～0.90 之间；大多数样品的水分含量超标，在65%～80%之间；所有样品中均检出了丙二醛，含量在5 mg/kg 以下；亚硝酸盐合格；所用样品总均含有挥发性盐基氮，含量在450 mg/100 g 以下；生物胺普遍存在，总含量均在550 mg/kg 以下。整体而言，在菌落总数、真菌数量、致病性肠杆菌数量、丙二醛、挥发性盐基氮和生物胺这些与安全性有关的指标方面，工厂生产的虾酱优于家庭自制的虾酱。因此，为确保传统发酵虾酱对消费者的安全性，应严格注意和规范生产过程，包括原料的预处理、发酵条件的优化、发酵过程中有害微生物的控制和有害产物的抑制以及发酵成品的杀菌。此外，建议有关部门对传统发酵虾酱的品质尤其是安全性进行全面的监督，并尽快制定相关标准。