ATXN1基因内CAG重复序列拷贝数增加对神经母细胞瘤细胞增殖与凋亡的影响

陈诗恺，孙顺昌

(上海交通大学医学院附属瑞金医院北院，上海 201801)

遗传性脊髓小脑型共济失调(SCA)是一组临床和遗传均具异质性的神经系统退行性疾病，主要临床表现为小脑性共济失调，可伴有构音障碍、意向性震颤、眼肌麻痹等症状[1]。SCA遗传模式以常染色体显性遗传为主，亦有常染色体隐性遗传和X-连锁隐性遗传等模式。从遗传学上可将SCA分为30多型，大部分型SCA致病基因已被克隆[2]。序列分析显示部分型SCA具有共同的基因突变特征，即由基因编码内的CAG序列重复数过多而引起，故这类SCA统称为多聚谷氨酰胺遗传性脊髓小脑型共济失调(PolyQ SCA)[3]。PolyQ SCA具有遗传早现现象，且CAG序列重复数会在亲子传递中发生变化，多数CAG序列重复数随父系遗传而增加，随母系遗传而减少[4]。SCA病理机制仍不完全清楚，其发病与突变产物的堆积有关，但在动物体内正常基因的过度表达亦可产生SCA症状[5]。2018年3～11月，本研究通过构建正常和突变的ATXN1基因，探讨ATXN1基因内CAG序列重复拷贝数增加对人胚肾293T细胞增殖能力和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人胚肾细胞(293T细胞)和感受态大肠杆菌细胞(Stbl3细胞)购自广州辉骏生物技术有限公司。DMEM细胞培养液、胎牛血清及胰酶购自Gibco公司。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒和CCK8购自上海碧云天公司。T4 DNA连接酶购自赛默飞公司，BC117125.1克隆质粒和pLVX-Puro-3xflag-SBPtag2-C载体、pMD2.G及psPAX2购自广州辉骏生物技术有限公司，AXTN1-MUT基因由广州辉骏生物技术有限公司合成。超净工作台(SW-CJ-2FD型)和生物安全柜(BHC-1300IIA/B3型)购自苏静集团有限公司，二氧化碳培养箱(3111型)和低温冷冻离心机(ST16R型)购自赛默飞公司。倒置显微镜(MF51型)购自广州明美光电有限公司，流式细胞仪(Guava EasyCyte型)购自Millpore公司，酶标仪(318CT)购自上海沛欧公司。

1.2 pLVX-Puro-3xflag-AXTN1表达载体构建 以BC117125.1克隆质粒为模板扩增正常ATXN1基因，人工合成突变AXTN1基因。回收扩增的目的片段AXTN1-WT和AXTN1-MUT，再用核酸内切酶EcoRI和XbaI进行双酶切，最后用T4 DNA连接酶接到pLVX-Puro-3xflag-C载体上，构建成pLVX-Puro-3xflag-AXTN1表达载体。

1.3 表达载体鉴定 将构建的pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT和pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-MUT表达载体分别导入感受态Stbl3细胞中进行克隆，收集菌液，抽提质粒。通过EcoRI和XbaI双酶切及测序鉴定构建的pLVX-Puro-3xflag-AXTN1表达载体。

1.4 AXTN1稳转细胞株的筛选及表达鉴定 将包装质粒和经鉴定构建正确的pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT或pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-MUT表达载体质粒共转染293T细胞，产生假慢病毒颗粒，通过超速离心法纯化假慢病毒颗粒。在polybrene作用下，用假慢病毒颗粒感染293T细胞，用puromycin筛选AXTN1稳转细胞株，通过Western blotting法鉴定表达载体表达正常的AXTN1蛋白和突变AXTN1蛋白。将培养的稳转细胞株进行细胞增殖与凋亡实验。

1.5 细胞增殖能力检测 将表达pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-MUT载体、表达pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT载体、转染pLVX-Puro-3xflag-C载体(阴性对照)的293T细胞分别接种至96孔培养板中，每株设定4个复孔，每孔细胞数为1×104个，分别培养1～5 d。测定前4 h每孔加入1/10体积CCK-8溶液孵育4 h后，酶标仪读取OD450值。

1.6 细胞凋亡率测算 培养293T稳转细胞株5 d后，将培养板中的培养基移至清洁的15 mL离心管中并置于冰上(保留已脱落的凋亡细胞)；培养板上的细胞先用PBS溶液洗净，然后用0.25%胰酶消化培养板，使细胞脱落，收集于冰上保留的原细胞培养液中；用PBS溶液洗净脱落细胞，用结合缓冲液制成500 μL 浓度为2×105/mL细胞悬液，再加入5 μL Annexin V-FITC混匀，最后加入Propidium lodide 5 μL混匀，室温避光反应15 min。用流式细胞仪(millpore, Guava EasyCyte)测定凋亡细胞百分率。

1.7 统计学方法 采用SPSS23.0统计软件。不同载体细胞增殖能力比较采用t检验，率的比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 293T细胞中AXTN1蛋白表达 通过慢病毒载体介导，293T细胞中成功表达出正常AXTN1蛋白和突变AXTN1蛋白，见图1。

注：MW：蛋白相对分子质量标记；NC：转染pLVX-Puro-3xflag-C载体的细胞；MUT：表达pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-MUT载体的细胞；WT：表达pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT载体的细胞。

图1 293T细胞中AXTN1蛋白表达

2.2 不同载体细胞增殖能力比较 表达pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-MUT载体的细胞在培养3～5 d，细胞的OD450值均低于表达pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT载体的细胞和只转染pLVX-Puro-3xflag-C载体的阴性对照细胞(P均<0.01)，而表达pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT载体的细胞和只转染pLVX-Puro-3xflag-C载体的阴性对照细胞在培养3～5 d的OD450值差异无统计学意义(P>0.05)。同表达正常ATXN1基因的293T细胞相比，表达突变ATXN1基因的293T细胞增殖能力下降(P<0.01)。见表1。

表1 不同载体细胞的OD450值比较

2.3 细胞凋亡率比较 培养细胞5 d后，阴性对照细胞的凋亡率为8.17%，表达pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT(正常ATXN1基因)载体的细胞凋亡率为9.06%，而表达pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-MUT载体(突变ATXN1基因)的细胞凋亡率为12.56%。表达突变ATXN1基因的293T细胞凋亡率高于表达正常ATXN1基因的293T细胞(P<0.01)，而表达正常ATXN1基因的293T细胞与转染阴性质粒293T细胞的凋亡率差异无统计学意义。见图2。

注：A：转染pLVX-Puro-3xflag-C载体的293T细胞；B：表达pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-WT载体的293T细胞；C：pLVX-Puro-3xflag-AXTN1-MUT载体的293T细胞。

图2 细胞凋亡的流式分析

3 讨论

部分神经退行性疾病的重要分子病理特征是基因编码区的CAG重复序列扩增超出正常范围，导致编码蛋白含超出正常长度的多聚谷氨酰胺序列，这些蛋白会出现错误折叠，产生蛋白聚体沉积在胞质或胞核内，这类疾病亦称PolyQ病[6]。常见的PolyQ病有遗传性脊髓小脑型共济失调、Huntington舞蹈病等[7]。遗传性脊髓小脑型共济失调中属于PolyQ病的型：SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA12、SCA17和齿状肌麻痹性萎缩(DRPLA)[8]。SCA1是ATXN1基因突变所致，ATXN1基因定位于染色体6p23，含7个外显子，其中外显子7含一段CAG重复序列，正常人重复数在7～38，SCA1患者的重复数在39～82[9]。CAG重复序列扩增导致神经元退行性改变的详细机制尚不清楚，但研究已发现了部分病变的分子基础[10]。敲除ATXN1基因的小鼠并未出现SCA1症状，提示ATXN1基因功能丢失并非SCA1发病的首要原因，但缺乏ATXN1蛋白可能会通过转录下调、蛋白相互作用减弱等机制影响神经元功能[11]。研究发现，突变ATXN1蛋白转位到细胞核内亦是SCA1发病的重要因素[12]。因此SCA1发病既有ATXN1突变蛋白的毒性作用，亦有正常ATXN1蛋白功能缺失的影响。本研究构建含正常和突变ATXN1基因的慢病毒表达载体，分析突变ATXN1蛋白对293T细胞增殖和凋亡的影响，以探讨SCA1发病的分子机制。

研究显示，SCA1发病的年龄与ATXN1基因内CAG重复序列长度呈负相关，CAG重复序列长度越长，其发病年龄越小。目前已报道的患者CAG重复序列最长达82次[13]。我们诊断的一个SCA1家系中先证者CAG重复序列长达61次，患者于18岁发病，首发症状为步态不稳，行走缓慢，24岁就诊时，出现意向性震颤、构音障碍、吞咽困难、腱反射亢进等症状，核磁共振检查显示小脑和脑干萎缩。该家系通过PCR及测序被诊断为SCA1家系。因此本研究构建的ATXN1突变基因含61次CAG重复序列。通过慢病毒载体介导，本研究在293T细胞中成功表达出正常和突变的ATXN1蛋白。

CCK8实验结果显示，导入突变AXTN1基因的细胞的增殖能力从第3天开始低于导入正常AXTN1基因的细胞，差异有统计学意义。细胞增殖实验结果显示，表达突变ATXN1基因的293T细胞增殖能力下降，差异有统计学意义，提示ATXN1基因内CAG重复序列拷贝数增加可抑制细胞的增殖能力，其机制有待进一步研究。SCA属于一种中枢神经系统退行性疾病，其病理表现为小脑浦肯野细胞丢失，丢失的原因可能为坏死性凋亡[14]。通过流式细胞仪测定培养5 d后的293T细胞的凋亡率发现，表达突变AXTN1蛋白的细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均高于表达正常AXTN1蛋白的细胞，提示突变AXTN1蛋白的表达促进了细胞凋亡，与SCA1患者的神经退行性改变相符。AXTN1基因内CAG重复序列变异导致细胞的增殖与凋亡能力改变可能是引起SCA1的病理机制之一。

综上所述，ATXN1基因内CAG重复序列拷贝数增加可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，CAG重复序列变异导致细胞的增殖与凋亡能力改变可能是引起SCA1的病理机制之一。