3 型鸭病毒性肝炎的诊断与病毒的分离鉴定

(上海创宏生物科技有限公司,上海闵行 201619)

鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis)是严重危害雏鸭的急性、烈性传染病,以3 周龄内的雏鸭最易感染,死亡率高达80%,给养鸭业带来了严重的经济损失。引发鸭病毒性肝炎的主要病原为1 型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)、2 型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-2)和3 型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3),DHAV-2 仅在台湾地区有发病报道[1]。目前DHAV-1 和DHAV-3 同时流行,DHAV-3 流行范围有扩大趋势[2-3]。

2016 年4 月,江苏某鸭场5 日龄樱桃谷鸭发病,通过临床症状、病理剖检和实验室诊断确定为鸭病毒性肝炎,并对病毒进行了分离和培养,现将诊断过程报道如下。

1 材料与方法

1.1 血清 DHAV-3 阳性血清,由武汉中博生物股份有限公司惠赠,中和效价为1∶2 512。

1.2 雏鸭 10 日龄樱桃谷鸭,购自河南华英农业发展股份有限公司,从2 日龄隔离饲养至10 日龄。

1.3 临床症状和病理剖检 雏鸭精神沉郁,不愿采食,卧地不起,之后出现神经症状,头垂地,运动失调,并很快死亡,死亡雏鸭呈角弓反张。剖检可见肝脏肿大,布满出血点和出血斑,肾脏、脾脏、胰脏均有出血,怀疑是鸭病毒性肝炎,建议鸭场紧急接种鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体,颈部皮下注射,0.5 mL/只。

1.4 病料采集与处理 取病死鸭肝脏,按组织重量1∶5(W/V)加无菌生理盐水后研磨制成匀浆,冻融后10 000 r/min 离心10 min,取上清液,提取病毒核酸并反转录,根据文献方法[4]进行PCR 鉴定。将阳性扩增产物进行核苷酸序列测定,并将获得的序列与GenBank 收录的其他毒株进行比对鉴定,并分析遗传进化关系。

1.5 病毒分离 将匀浆上清液用0.22 μm 针孔式滤器进行过滤,并将滤过液经尿囊腔接种10 日龄易感鸭胚10 枚,0.2 mL/枚,置37 ℃孵化器孵育,记录鸭胚死亡情况,收获48 -144 h 死亡鸭胚的尿囊液,并进行无菌检验。将无菌检验合格的尿囊液,按同样方法接种鸭胚盲传2 代,即获得第3 代尿囊液。

1.6 病毒纯化 使用终点稀释法对病毒进行纯化[5]。具体方法如下:将第3 代尿囊液用无菌生理盐水做10 倍系列稀释,取10-3、10-4和10-5三个稀释度,每个稀释度经尿囊腔接种10 日龄鸭胚5 枚,0.1 mL/枚,置37 ℃孵育。接种后观察144 h,死亡胚于2～8 ℃冷藏(24 h 内死亡胚弃去),将最高稀释度致死的胚分别收获尿囊液,按相同方法再连续传代2 次,即获得第6 代鸭胚尿囊液,并扩大培养收获胚体制成第7 代病毒液。

1.7 病毒含量测定 取第7 代病毒液用无菌生理盐水分别作10-3、10-4、10-5、10-6系列稀释,每个稀释度分别经尿囊腔接种10 -11 日龄易感鸭胚5枚,0.1 mL/枚,置37 ℃孵育,观察7 日,记录死亡情况(24 h 内死亡胚不计),按Reed-Muench 法计算鸭胚半数致死量(DELD50)。

1.8 PCR 鉴定 参照已报道的鸭常见病毒病检测方法[6-8],检测第7 代病毒液中是否含有鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鸭乙型肝炎病毒和鸭呼肠孤病毒等常见病毒。

1.9 血清学鉴定 将第7 代病毒液用无菌生理盐水稀释至200 DELD50/0.2 mL,分为2 组,一组与等量DHAV-3 阳性血清混合;另一组与等量无菌生理盐水混合,均置37 ℃作用1 h,分别经尿囊腔接种10 -11 日龄易感鸭胚10 枚,0.2 mL/枚。置37 ℃孵育7 日,记录鸭胚死亡情况(24 h 内死亡胚不计)。

1.10 对雏鸭的毒力 将20 只10 日龄雏鸭随机分为2 组,每组10 只,一组作为攻毒组,经腿部肌肉接种10 倍稀释的第7 代病毒液,0.5 mL/只;另一组作为空白对照组。攻毒后于隔离器中饲养观察7 日,记录雏鸭死亡情况,将死亡雏鸭剖检,观察病变情况。

2 结果

2.1 PCR 鉴定结果 使用3 型鸭甲型肝炎病毒引物扩增出1 条特异性条带。将扩增产物进行核苷酸序列测定,并与GenBank 收录的其他DHAV 毒株的VP1 基因序列进行比对,结果见图1。第7 代病毒液VP1 基因序列与DHAV-3 代表毒株的同源率为91.8%～98.6%,与DHAV-2 代表毒株的同源性为72.5%,与DHAV-1 代表毒株的同源性为67.8%～68.2%。遗传进化关系表明,第7 代病毒液所含病毒与DHAV-3 病毒株关系比较密切(图2),确定为3 型鸭甲型肝炎病毒,命名为3 型鸭甲型肝炎病毒JS 株(DHAV-3 JS 株)。

图1 序列比对

图2 遗传进化分析

2.2 病毒分离和纯化结果 将病料接种10 日龄易感鸭胚后,鸭胚在120 h 内5/5 死亡,剖检,胚体出血,肝脏肿大出血(见中插彩版图3)。收获尿囊液连续传代2 次鸭胚均在120 h 内死亡,剖检死亡鸭胚症状相同。将尿囊液继续进行3 代纯化传代后,接种鸭胚,72 -96 h 出现死亡高峰。

图3 病毒致死鸭胚

2.3 病毒含量测定结果 测定第7 代病毒液病毒含量为l05.83DELD50/0.1 mL。

2.4 PCR 鉴定结果 鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鸭乙型肝炎病毒和鸭呼肠孤病毒扩增结果为阴性。

2.5 血清学鉴定结果 血清中和组鸭胚均不发生死亡,病毒对照组鸭胚全部死亡,表明JS 株能被DHAV-3 阳性血清中和。

2.6 对雏鸭的毒力试验结果 攻毒组雏鸭在接种后2 d 内发病,发病雏鸭精神沉郁,缩颈,随即死亡,死亡鸭呈角弓反张,剖检可见肝脏肿大,点状或斑状出血(见中插彩版图4A);3 d 内死亡70%。空白对照组雏鸭全部健活,无临床症状,剖检均无明显病变(见中插彩版图4B)。

图4 雏鸭剖检肝脏图片

3 讨论

鸭病毒性肝炎是危害养鸭业的主要疾病之一。近年来,鸭病毒性肝炎病原在我国的分布比较复杂,DHAV-1 仍在我国养鸭业流行,但是DHAV-3 的流行已非常广泛[9],已成为我国养鸭业主要流行的基因型。本试验通过发病鸭的临床症状、病理剖检并结合实验室诊断确定导致该养鸭场发病死亡的病原为3 型鸭甲型肝炎病毒。通过动物回归试验,将病毒接种雏鸭后,雏鸭死亡率为70%,表明该病毒毒力较强,鸭场在紧急接种鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体后,雏鸭发病情况已得到有效控制,发病率和死亡率降低,但是并未得到根除,每天仍有雏鸭发病和死亡,鸭场已在首次接种卵黄抗体5 d 后再次进行接种。

做好鸭场的生物安全工作是预防鸭病毒性肝炎的有效方法,然而在我国目前公司+农户的养殖模式下,很多地区养鸭条件较为有限,很难做到彻底消毒,发生鸭病毒性肝炎后很容易造成细菌的继发感染,给养殖户带来经济损失;因此在购进雏鸭之后进行活疫苗免疫是预防该病的关键,然而目前市场上尚无3 型鸭甲型肝炎活疫苗,应当加快研发进程。