齐兴肉兔和伊拉兔MC4R、GHR 基因SNP 的检测

刘 兰，俞成浩，邝良德，黄 林，金素钰，杜倩男，周凡莉，郑玉才

(1.西南民族大学现代生物技术国家民委重点实验室，四川 成都 610041；2. 四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066)

黑素皮质素受体－4 (Melanocortin －4 receptor，MC4R)是下丘脑腹内侧核分泌的一类肽类物质，是调节能量平衡的一个主要信号分子，主要功能是控制体重、食欲和能量代谢[1].Jiang 等人发现，6 个家兔品种的MC4R 基因在237 位发生(A→G)突变，AG 基因型与兔的体重、全净膛重以及饲料转化率有显著关系[2]；El－Sabrout 和Soliman 在兔的MC4R 基因发现35 位核苷酸(T→G)和19 位核苷酸(T→C)的变异与家兔采食量有显著关系[3]；通过单核苷酸多态性(SNP)检测不同品种兔的MC4R 基因，发现兔的MC4R 基因的多态性与体重有显著关系[3－4].这些结果提示兔的MC4R 基因在控制体重、肉质、采食量和能量平衡等过程中的重要作用.

生长激素是由脑垂体前叶分泌的一种蛋白质激素，在脊椎动物的生长、发育等过程中有重要作用.生长激素发挥生理作用必须先与靶细胞膜表面的生长激素受体(Growth hormone receptor，GHR) 结合[5].大量资料显示，GHR 基因的SNP 对活重、内脏重和屠宰率、营养状况、采食量等有明显的影响.Fontanesi 等研究发现所检测CHR 基因的SNP 与家兔70 天时体重有关，且最常见的GG 基因型存在于较高体重的家兔中[6]；Deng 等对5 个家兔群体的GHR 基因多态性进行分析，发现C705T 和C810T 两个SNP，通过分析发现，GHR 基因是影响兔体重和屠宰率等屠宰性状的主要候选基因[7].

兔目前是一些国家的重要食物来源之一.齐兴肉兔和伊拉兔两个品种均有繁殖性能好，遗传稳定，饲料报酬率高，生产性能好，适应性广，抵抗力强的特点，具有较大的发展空间和社会经济价值[8]. 家兔研究领域的分子生物学技术现已成为检测经济性状相关标记的重要手段[3].在育种中来自相关基因的数据有可能提高选育的准确性[9]. 此外，SNP 是检测DNA序列突变的有效方法[10]. 本研究检测了2 个生长相关基因(黑皮质素4 受体、生长激素受体)序列在齐兴肉兔和伊拉兔中的遗传变异，探讨了它们在两品种间的差异.

1 材料与方法

1.1 样品的采集

试验动物为齐兴肉兔和伊拉兔，各30 只，饲养于四川省畜牧科学研究院肉兔科研基地. 耳静脉采血，EDTA 抗凝，用冰盒将抗凝血带回实验室，－80℃保存至分析.

1.2 主要仪器和试剂

C1000 梯度PCR 仪、Power/Pac 3000 电泳仪、VersaDoc 1000 凝胶成像系统，均购自美国Bio －Rad公司；Eppendorf Minispin plus 微型离心机，购自德国Ep－pendorf 公司.

Chelex 100 树脂，购自Bio －Rad 公司；DL －2000 DNA Marker、金牌Mix Green，购自北京擎科新业生物技术有限公司；SuperRed/GelRed 核酸染料，购自合肥新恩源生物技术有限公司；琼脂糖等试剂均为国产.

1.3 兔MC4R、GHR 基因片段的PCR 扩增及分析

采用Chelex 100 提取实验兔抗凝血中基因组DNA[11]，PCR 技术扩增实验兔MC4R 和GHR 基因片段，引物序列与El － Sabrout 和Aggag 研究中的相同[12]，并由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成.MC4R 基因引物:F:5′ －CAACCCCAGTTACCAGCACT－3′，R:5′ － GCATTGCTGTGCAGTCCATA －3′，退火温度65 ℃，预期扩增长度500 bp.GHR 基因引物为:F:5′ － AATCCACCTTCAACCCTATC －3′，R:5′ － CG-GAGACTTCTTACAATGGC－3′，退火温度56 ℃，预期扩增长度263 bp.

PCR 反应体系(25 μL):上、下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL 及22 μL 金牌Mix Green.两个基因片段PCR 扩增程序仅退火温度不一样，其余条件均一致[13].PCR 产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，将电泳条带清晰、特异性好的PCR 产物送生工生物工程(上海) 股份有限公司进行直接单向测序，其中，MC4R 基因的PCR 产物从反向测序，GHR 基因从正向测序.使用DNAMAN 软件将测得的序列分别与兔MC4R (登录号: XM＿002713616 )、GHR (登录号: 100009325)的基因序列进行比对.

2 结果

2.1 兔MC4R、GHR 基因片段的PCR 扩增

用Chelex 100 方法从齐兴肉兔和伊拉兔抗凝血中快速提取基因组DNA，并用PCR 扩增MC4R 和GHR 基因片段，用2%的琼脂糖凝胶检测产物，结果每个样品均显示出特异的清晰条带，长度与预期片段大小吻合(图1).

图1 齐兴肉兔和伊拉兔MC4R、GHR 基因的PCR 扩增Fig. 1 PCR amplification of MC4R and GHR genes in Qixing meat rabbit and Ira rabbit

2.2 齐兴肉兔和伊拉兔MC4R、GHR 基因的SNP 分析

兔MC4R 基因PCR 产物单向测序获得的准确片段长度为425 bp，两个品种中均检测到5 个SNP，位于外显子1 的5′－非编码区(图2)，分别为c. －143 A>G、c. －322 G>C、c. －347 A>G、c. －360 G>A、c. －362 C>G.兔GHR 基因PCR 产物单向测序获得的准确序列长度为222 bp，在两品种中均检测到1 个SNP，即g.63343609 T>G，在内含子1 中.

图2 齐兴肉兔MC4R 基因(A)和GHR 基因(B)的同源性比对Fig. 2 Homology alignment of MC4R gene (A) and GHR gene (B) in Qixing meat rabbit

根据测序结果并与兔MC4R 基因(登录号: XM＿002713616)比对[4]，统计上述MC4R 基因5 个SNPs的基因型频率和等位基因频率(表1).一个重要的发现是，在5 个SNP 位点中，伊拉兔的A 等位基因频率均比齐兴肉兔高；在c. －322 C>G、c. －347 T>C、c.－360 C >T 位点中，齐兴肉兔的B 等位基因频率均在0.6 以上，而其它位点的B 等位基因频率均在0.6以下；在c. －347 T >C 和c. －322 G >C 中，齐兴肉兔和伊拉兔的杂合子AB 型频率均一样，而其余3 个SNP 齐兴肉兔的杂合子AB 型频率均高于伊拉兔. 实验兔MC4R 基因的c. －143 T>C 测序峰图见图3.

在GHR 基因g.63343609 T >G 多态位点中，仅检测到G 等位基因，齐兴肉兔和伊拉兔均只显示GG纯合基因型.

表1 齐兴肉兔和伊拉兔MC4R 基因SNPs 位点的基因型频率和基因频率Table 1 Genotypefrequency and gene frequency of MC4R gene in Qixing meat rabbit and Ira rabbit

图3 兔MC4R 基因部分测序峰图Fig. 3 Partial sequencing peak map of MC4R in rabbit

3 讨论

大量研究表明，MC4R 和GHR 都对动物生长发育起着至关重要的调控作用.MC4R 基因主要在下丘脑中表达，在下丘脑中起控制食欲(饲料摄入量)和饱腹感的作用，进而影响体重[14]；生长激素首先与GHR 结合，然后才能激活胰岛素生长因子1 的表达，对动物的活重、内脏重和屠宰率、营养状况、采食量等有明显的影响[5].目前，关于人、猪以及家禽MC4R 和GHR 基因多态性以及相关研究已有较多报道[15－17].本研究首次用PCR 扩增齐兴肉兔和伊拉兔的MC4R和GHR 基因的部分序列，通过测序在GHR 基因内含子中发现1 个SNPg.63343609 T >G，该突变在El －Sabrout 和Aggag 研究中为无义突变[13]. 本试验在齐兴肉兔和伊拉兔中均检测到该位点且只显示GG 基因型，提示该位点对两品种兔的生长可能没有太大影响.

本试验在MC4R 基因中发现5 个SNP，这些SNP位点都在外显子的非翻译区，且在Fontanesi 等研究中均有报道[4]为同义突变.Fontanesi 等在银兔和比利时兔中检测到两种常见的单倍型1(频率＝44/62)和单倍型2(频率＝11/62)，携带突变的天冬氨酸氨基酸.还检测到另外两个低频率的单倍型3(频率＝3/62)和单倍型4(频率＝1/62)，这些变异可能会破坏转录因子的潜在结合位点，由此提示本研究中的c.－347A>G 和c. －322 G>C 位点的突变有可能影响MC4R 基因的表达. El － Sabrout 和Aggag 研究发现[13]，MC4R 基因的SNP 位点c. －143 A >G 与两个兔品种间的63 天高体重呈显著相关(P <0.05). 本试验中，MC4R 基因c. －143 A >G 位点，伊拉兔突变的G 等位基因频率比齐兴肉兔高，推断伊拉兔的生长速度比齐兴肉兔快或许与此有关. 因此，齐兴肉兔与伊拉兔MC4R 基因的单核苷酸多态性有可能与生长性状有关联，为了提高其生产性能，可考虑将MC4R基因作为影响兔生长的候选基因，这对繁育优良肉兔品种具有指导意义.