牦牛DIO2 基因克隆及其在骨骼肌的表达分析

熊 燕，赵 丹，刘静怡，石 超，宋紫文，华永林，张 静，柏 雪，李 键，熊显荣

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川 成都 610041；3.西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室，四川 成都 610041)

牦牛(Bos grunniens)是青藏高原及其毗邻高山、亚高山地区的特有畜种，素有“高原之舟”的美称. 牦牛肉具有丰富的营养价值，是符合现代市场需求的绿色食品[1].畜禽胴体中最主要的组织为骨骼肌，其生长发育速度决定畜禽的产肉性能，肌纤维类型的组成与肌肉的品质紧密相关[2].目前根据肌纤维能量代谢特点，可将其划分为氧化型(I 型)、氧化糖酵解型(IIa/IIx 型)和糖酵解型(IIb 型)，其中I 和IIb 型分别为典型的快肌和慢肌纤维. 研究表明在牦牛肉中，快肌纤维含量越高，牦牛肉初始嫩度越差，肉质的嫩度改善差，反之亦然[3].因此，研究畜禽骨骼肌的生长发育及肌纤维类型组成对增加畜禽产肉性能及改善肉质极其重要.

哺乳动物骨骼肌的生长、肌纤维类型决定及其转化受到机体激素水平的调控.科学家发现甲状腺激素对小鼠骨骼肌肌纤维有决定作用[4]，缺乏甲状腺激素，会降低四头肌RNA、蛋白质及细胞色素的含量[5]；在鸟类的研究中，机体内甲状腺激素升高导致鸟类骨骼肌的再生[6]，以上研究表明甲状腺素信号通路参与调控骨骼肌生长及肌纤维类型的形成.甲状腺激素主要由血液中的酪氨酸碘化物四碘甲腺原氨酸(Tetraiodothyronine，T4)和组织中有生物活性的三碘甲腺原氨酸(Triiodothyronine，T3)组成，其作用绝大部分取决于T3 的含量[7].研究报道T3 的合成通过脱碘酶经脱碘作用将T4 转化为T3[5]，该过程中有三种脱碘酶参与，即Ⅰ型(type 1 deiodinase，D1)、II 型(type 2 deiodinase，D2)和Ⅲ型脱碘酶(type 3 deiodinase，D3)[8]，其中DIO2(typeⅡiodothyroninedeiodinase gene)作为2 型脱碘酶基因，在动物的多个组织和器官中均有表达[9].最新发现DIO2 的缺失会导致小鼠骨骼肌肌纤维的类型向快肌转化，提高IIb 型快肌纤维的数量[10].然而牦牛与上述动物相比，由于高原环境的长期选择作用，导致其骨骼肌的生长及肌纤维类型的组成具有特异性，DIO2 是否参与上述生物学过程未知.

因此，本实验首先克隆牦牛DIO2 基因的CDS 序列，然后利用生物信息学方法分析DIO2 基因在物种间的保守性及预测其理化性质，最后采用qRT －PCR分析DIO2 在金川牦牛和麦洼牦牛骨骼肌的差异表达，为后续研究DIO2 基因在骨骼肌的功能提供基础数据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

4 岁左右的金川公牦牛和麦洼公牦牛各4 头，均由四川阿坝羌族藏族自治州金川县庆林乡牦牛养殖场提供. 屠宰后立即采集肝、脾、肺、肾、皮下脂肪、背最长肌和半腱肌等组织，放置于液氮罐中，置于－80 ℃低温储藏备用.

1.1.2 主要仪器及试剂

PCR 仪(Bio－Rad C1000)、Trizol 试剂、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、pGM －T 链接试剂盒与大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 a感受态细胞均购自于成都鹏世达实验用品有限公司；荧光定量试剂盒、DL 2000 DNA Marker 及LA Taq 酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司(Takara 中国).

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成

根据NCBI 数据库中牦牛DIO2 的预测序列(GenBank 注册号:XM＿014482051.1)进行克隆引物的设计，设计软件为Primer premier 5.0.如表1 所示，引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成.

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 RNA 的提取及反转录

组织总RNA 由Trizol 试剂提取，然后采用微量核酸蛋白测定仪检测总RNA 浓度及OD260/OD280 值，此值在1.8 ～2.0 则符合要求，置于－80 ℃保存备用.按照反转录试剂盒的说明书进行cDNA 的合成.

1.2.3 牦牛DIO2 基因克隆

以4 头金川牦牛肌肉组织cDNA 为模板，PCR 反应体系如下:上下游引物(10 μM)各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 5.5 μL，PCR Mix 7.5 μL.PCR 反应程序如下:94 °C 预变性4 min，94 ℃变性45 s，退火温度61 ℃45 s，72 ℃延伸1 min，40 个循环，72 ℃延伸7 min.

将PCR 产物进行1.5%凝胶电泳，对目的条带进行胶回收.将胶回收产物与pGM －T 载体16 ℃连接过夜，然后转化入DH5 a感受态细胞，吸取适量菌液涂于固体培养基培养12 ～16 h，挑选3 ～5 个克隆扩大培养.将菌液送往成都擎科梓熙生物技术有限公司进行双向测序，对测序结果进行拼接得到DIO2 基因的CDS 全长序列.

1.2.4 牦牛DIO2 生物信息学分析

根据获得的牦牛DIO2 的CDS 序列，分别做如下7 个方面的生物信息学分析:(1)NCBI 的ORF Finder(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)寻找开放阅读框，获得氨基酸序列.(2)NCBI 中BLAST 软件进行同源性比对，然后利用MEGA5.0 软件构建进化树.(3)ProtParam 软件分析牦牛DIO2 基因的理化性质.(4)ProtScale 软件在线分析牦牛DIO2 基因蛋白的亲疏水性.(5)TMpred 软件在线蛋白质的跨膜区. (6)NetPhos 3.1 Server 软件对DIO2 蛋白的磷酸化位点预测.(7)分别用HNN 在线工具和SWISS －MODEL 软件预测牦牛DIO2 蛋白的二级和三级结构.

1.2.5 qRT－PCR

利用Primer Premier 5.0 软件设计目的基因的荧光定量特异引物，如表1 所示，引物送往成都擎科梓熙生物技术有限公司进行合成.内参基因选用环孢素A 受体(peptidylprolylisomerase A，PPIA). 以上述的cDNA 为模板，采用qRT －PCR 法检测DIO2 在牦牛各组织中的表达差异. 反应体系如下:上下游引物各0.3 μL，RNase－freeddH2O 2.9 μL，cDNA 模板4 μL，SYBR Green 7.5 μL. PCR 反应条件:95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，60℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环.定量所得数据利用2－ΔΔCt法进行分析.结果采用SPSS 18.0 分析软件中的ANOVA 程序进行单因素方差分析.

2 结果与分析

2.1 牦牛DIO2 基因序列结果分析

本实验以肌肉组织的cDNA 为模板，利用设计的引物对DIO2 基因进行PCR 扩增，结果如图1A 所示，结果如图1A 所示，克隆得到牦牛DIO2 基因的序列总长度为839 bp，其CDS 区全长为789 bp.将条带进行胶回收后，连接pGM －T 载体，送往公司进行双向测序，拼接序列与预测结果一致(如图1B).然后将牦牛DIO2 基因利用NCBI ORF Finder 进行开放阅读框分析，发现有一个399 bp 的开放阅读框，编码132 个氨基酸.

图1 牦牛DIO2 基因克隆Fig. 1 Gene clone of DIO2 in yak

2.2 牦牛DIO2 基因在不同物种之间的同源性比较

利用NCBI 中BLAST 分析模块，对普通牛(Bosta-urus)、绵羊(Ovisaries)、山羊(Capra hircus)、猪(Suss-crofa)、家猫(Feliscatus)、人(Homo sapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)、大鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Mus-musculus)、和原鸡(Gallus gallus)的DIO2 基因的核苷酸和氨基酸序列进行同源比对. 如表2 所示，牦牛与普通牛的核苷酸和氨基酸同源性高达100%，与原鸡的同源性较低，分别为79.17%和76.30%.然后利用MEGA5.0 软件根据序列的同源性构建进化树，聚类结果与同源性比对结果一致，如图2 所示牦牛和普通牛聚为一类，牦牛与同为反刍动物的绵羊和山羊亲缘关系最近，与原鸡的亲缘关系最远.

表2 牦牛DIO2 基因与其他物种的核苷酸及氨基酸序列比对结果Table 2 Nucleotide and amino acid sequence alignment of yak DIO2 gene with other species

图2 牦牛与其他物种的DIO2 基因系统进化树Fig. 2 Phylogenetic tree of DIO2 gene in yak and other species

2.3 DIO2 蛋白质理化性质及其蛋白质结构预测

利用ProtParam 软件分析显示牦牛DIO2 蛋白分子质量为14 484.75. 含有20 种氨基酸，其中Leu 和Ser 含量较高，所占比例为15.2%和11.4%；Trp 色氨酸和Tyr 酪氨酸含量较低，均为1.5%(表3). DIO2蛋白理论等电点(pI)为6.26，有13 个带负电荷的残基总数(Asp ＋Glu)，12 个带正电荷的残基总数(Arg＋Lys).其在哺乳动物网织红细胞中的半衰期为30 h，属于不稳定蛋白.

表3 牦牛DIO2 基因氨基酸组成Table 3 Amino acid composition of yak DIO2 gene

利用ProtScale 软件分析显示，牦牛DIO2 蛋白表现为疏水性(图3A).如图3B，TMpred 软件分析发现DIO2 蛋白质在第16 ～37 位具有跨膜结构区(分值>0 表明存在跨膜区域). NetPhos 3.1 Server 软件预测牦牛DIO2 蛋白有15 个丝氨酸(Ser5、Ser20、Ser30、Ser42、Ser44、Ser46、Ser57、Ser66、Ser84、Ser85、Ser90、Ser91、Ser98、Ser119 和Ser130)、7 个苏氨酸(Thr11、Thr47、Thr56、Thr97、Thr106、Thr110 和Thr132)及2 个酪氨酸(Tyr28 和Tyr72)磷酸化位点(图3C)，推测这些磷酸化位点可能与DIO2 的激酶活性有关. 此外，HNN 在线工具预测DIO2 蛋白主要由a －螺旋(59 个氨基酸残基，Hh:44.7%)、无规则卷曲(51 个氨基酸残基，Cc:38.64%)和延伸链(22 个氨基酸残基，Ee:16.67%)组成(图3D).通过SWISS －MODEL 软件预测牦牛DIO2 蛋白三级结构，如图3.E 所示，该三级结构与二级结构预测结果基本一致，由无规则卷曲、a－螺旋和延伸链三者交替出现.

图3 DIO2 基因生物信息学分析Fig. 3 Bioinformatic analysis of DIO2 in yak

2.4 牦牛DIO2 基因组织表达分析

利用qRT－PCR 方法检测DIO2 基因在牦牛不同组织中的表达，结果显示DIO2 基因在牦牛脾、肺等内脏组织均有表达，但组织间差异不显著(图4A).在脂肪、肝、骨骼肌等能量代谢相关组织的表达中，脂肪的表达量最低，背最长肌和半腱肌的表达量极显著高于脂肪组织和肝脏组织(P <0.01)，如图4B 所示.不同部位骨骼肌表达量比较研究发现，牦牛半腱肌DIO2基因的表达量具有高于背最长肌的趋势(P ＝0.06，图4B).进一步对金川牦牛和麦洼牦牛比较分析显示，肉质相对细嫩的金川牦半腱肌的DIO2 表达量显著高于麦洼牦牛(P <0.05，图4C). 综上表明，DIO2 在骨骼肌中具有较高的表达量，且金川牦牛半腱肌的表达量高于麦洼牦牛.

图4 牦牛DIO2 基因的组织表达分析Fig. 4 Tissue expression analysis of DIO2 gene in yak

3 讨论

本实验克隆了牦牛DIO2 基因的CDS 序列全长为798 bp，有一个399 bp 的开放阅读框，编码132 个氨基酸.生物信息学预测DIO2 是一种不稳定的疏水性蛋白，蛋白结构由无规则卷曲和螺旋构成. 物种同源性分析发现牦牛与普通牛同源，并且与其他几个物种之间的同源性也相对较高，可推测出DIO2 基因序列在物种间高度保守.

目前研究报道了DIO2 基因在下丘脑、大脑、小脑、甲状腺、睾丸、子宫等性腺轴相关组织的表达[11－12]，本次实验检测了DIO2 基因在牦牛的脾、肺、肾、肝、脂肪、半腱肌和背最长肌的表达，发现DIO2 基因在骨骼肌中有较高的表达量. DIO2 基因参与调控肾上腺素T3 的生成，大量研究表明骨骼肌为肾上腺素作用的主要靶组织，调节出生后动物肌肉的发育、生长及能量代谢[13－15].本研究发现牦牛半腱肌DIO2基因的表达量与背最长肌相比，具有较高的趋势. 以前的研究报道不同部位肌肉组织肌纤维类型组成比例存在较大差异，半腱肌与背最长肌相比，半腱肌的慢肌比例较高[16]. 在其他物种中，敲除小鼠DIO2 基因抑制骨骼肌中T4 向T3 的转换，降低骨骼肌T3 的水平，导致比目鱼肌中慢肌纤维的比例下降[17].因此我们推测DIO2 可能与骨骼肌慢肌纤维类型的决定有关.此外，金川牦牛和麦洼牦牛的比较分析发现，金川牦牛半腱肌DIO2 基因的表达量显著高于麦洼牦牛，本课题组前期对二者舍饲育肥条件下肌肉品质比较，表明金川牦牛肉肌肉剪切力低，肉质相对细嫩，并且肌内脂肪含量较高[18]. 研究报道，DIO2 基因调控脂肪细胞脂质沉积及脂肪酸的代谢[19]，是否其参与肌内脂肪的沉积需要进一步研究.综上分析，DIO2 基因可能在骨骼肌的生长及慢肌纤维类型的决定方面的调控发挥重要作用.

牦牛长期处于高原缺氧环境下，其骨骼肌发育及肌纤维类型形成的分子机制具有特异性[20]. 研究表明动物在低氧环境下，组织中线粒体的密度显著升高，肌纤维的生长相对缓慢[21－22]. T3 直接处理小鼠骨骼肌2h 后，导致骨骼肌快肌和慢肌中P38 和AMPK 的磷酸化水平升高[17]，同样大鼠注射T3，可快速激活骨骼肌纤维中的激酶，这些激酶涉及线粒体的生成、体积的增加及肌纤维的收缩[23]. 此外，研究报道骨骼肌线粒体的融合，会促进慢肌纤维形成[24].尽管本研究显示DIO2 基因在半腱肌的表达量高于背最长肌，半腱肌的慢肌纤维含量与背最长肌相比，较为丰富[16].但考虑到牦牛所处高原环境的长期影响，DIO2 基因调控其骨骼肌生长及肌纤维类型决定的分子机制需要进一步的研究.

4 结论

本研究成功克隆出了牦牛DIO2 基因序列，CDS序列全长为798bp，编码132 个氨基酸.通过同源性对比，发现DIO2 在物种间高度保守.组织表达分析发现DIO2 基因在牦牛各个组织中均有表达，但在骨骼肌中的表达量最高. 金川牦牛与麦洼牦牛比较分析显示，金川牦牛DIO2 基因在半腱肌的表达量显著高于麦洼牦牛.