基于可培养法分析新疆葡萄与葡萄酒相关酵母菌菌群结构

王冠群， 杨创举， 朱丽霞*

(1.塔里木大学 生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)

新疆所处地理位置深居内陆，远离海洋，具有独特的大陆性气候，因其地理特殊、气温高、降水少、日照时间长等环境特点使新疆成为优质葡萄栽培地和葡萄酒的酿造地，新疆的葡萄主产区几乎与法国的优质葡萄产区处于同一纬度[1]。新疆得天独厚的气候与资源优势造就了微生物及酵母菌资源的多样性、独特性和复杂性。新疆具有种植优良的葡萄、优质的酿酒酵母及酿制优良葡萄酒的风土条件。由于具有悠久的酿造历史，新疆各大葡萄产区和酿酒基地形成了一个独特且稳定的微生物环境，具有大量适应本土酿造葡萄酒的酵母菌，极具研究价值。新疆天山北麓与法国波尔多、美国加州那帕山谷同处在北纬44°，阳光充足，土地贫瘠，水质纯净，土壤富含钾、钙等矿物质，为葡萄的种植提供了优良的自然条件[2]。目前，专家学者对新疆葡萄酒相关酵母的研究主要集中在玛纳斯、石河子、吐鲁番、鄯善等地，发现葡萄酒相关酵母菌具有丰富的多样性。本研究通过对全疆各地采样并分离鉴定，期望对新疆酵母菌多样性做出较为全面的分析，这对新疆葡萄酒酵母资源研究具有一定的理论和实际意义。传统的酿酒酵母分类鉴定主要根据酵母菌形态学特征以及生理生化试验特征，再参照相关鉴定手册，才能进行相关菌种的鉴定。传统鉴定工作量大、周期长、操作复杂且鉴定结果的重复性差[3]。使用WL培养基鉴别酵母菌，是一种相对传统的常规鉴定方法而言较为快速的常用鉴定方法[4]。酵母菌在WL培养基上培养后会根据其所呈现不同的菌落形态和颜色，来区分不同的酵母菌，因此WL培养基也可以用于分类鉴定常见的葡萄酒相关酵母菌[5]，分类结果较为准确。随着对酵母基因组的不断认识和深入，现代分子学鉴定方法已经成为快速准确的分类鉴定方法，26S rDNA D1/D2、5.8S-ITS 等序列分析方法在酵母菌的种间鉴定方面具有很大的优势[6-7]。现代分子学鉴定方法具有稳定性好、便于操作、快速准确的优点。将酵母菌的表型特征与基因型特征结合起来对分离葡萄酒酵母菌进行鉴定，对分析其多样性具有重要的意义，同时也有利于深入准确地了解酵母菌种资源在新疆各产区的分布。本研究利用WL营养琼脂培养基对新疆地区的葡萄酒相关酵母进行了初步分类，并对代表菌进行了分子鉴定，研究了表型多样性与种群多样性，旨在探明新疆葡萄酒相关酵母菌的分布规律。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 菌株分离自新疆沿天山北带、伊犁河谷地区、吐鲁番地区、环塔里木盆地地区的葡萄种植区及酿酒地。从隶属于新北疆的60个县市、建设兵团13个师所采集的565份葡萄、104份土样、33份葡萄酒厂样品中分离得到的3 991株新疆本土葡萄酒酵母菌。

1.1.2 培养基 YPD培养基[8]：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，蒸馏水配制，自然 pH 值，121 ℃高压灭菌20 min；WL培养基：商用培养基80 g/L，经加热煮沸至完全溶解，分装后115 ℃高压灭菌15 min。

1.1.3 主要试剂 酵母膏、蛋白胨、葡萄糖(天津市致远化学试剂有限公司)； WL营养琼脂培养基(北京陆桥技术有限责任公司)，5.8S-ITS引物 ITS1 /ITS4、26S rDNA D1/D2引物 NL1/NL4(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌WL培养基表型分类 经活化(吸取经25%甘油保藏的菌液于装有1 mL灭菌的YPD培养基中，接种量为5%，(28±1) ℃恒温培养24 h)后的菌株，在WL培养基上划线接种，28 ℃培养3～8 d，观察并记录菌落大小及形态，包括质地、颜色、表面特征、侧面特征、边缘特征等，进行分析和初步归类。

1.2.2 酵母菌分子鉴定 DNA的提取采用冻融法[9]，5.8S-ITS区和26S rDNA D1/D2 PCR扩增条件及系统发育分析参照文献[10]，将PCR 产物委托上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果用BLAST进行相关序列搜索，与GenBank数据库中现有的近缘菌株进行序列比较，构建系统发育树[11]。

2 结果与分析

2.1 酵母菌WL表型特征观察及初步聚类分析

根据酵母菌在WL培养基上的菌落形态及颜色，将3 991株葡萄酒酵母菌分为22类WL表型，通过WL营养琼脂培养基菌落表型观察与Cavazza等[12]的描述10对比分析(表1)，其中WL3、6、11、12确定为毕赤属酵母(Pichia)，表型WL8、16为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，WL18为红酵母(Rhodutorula)，WL5、15为克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)，WL4为梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)，WL9为膜璞毕赤酵母(Pichiamembranifaciens)，WL10、13、14、17、19为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporaopuntiae)，WL1、2、7、20、21、22在文献中未提及。

表1 WL营养琼脂培养类型及其描述

表2 新疆葡萄酒相关酵母各WL类型菌株数统计表

由表2可知，新疆全疆各地分离出的葡萄酒相关酵母，WL8为2 458株(占总菌株的61.59%)，WL2为356株(占总菌数的8.92%)，多于100株的WL表型为WL1、WL3、WL4、WL5、WL19。

3 991株葡萄酒相关酵母的WL表型进行分布矩阵(图1)，由图1可知，WL1、2、3、8、19表型广泛存在于新疆各地区和酒厂内，其中WL8存在于新疆所有地区及酒厂内。昌吉和伊犁地区酵母菌菌落形态最多，达18种；叶城地区和中信国安酒厂、乡都酒业、野果林的菌落形态最少，仅有1种，均为WL8。

2.2 分子系统学分析和分类

从葡萄酒相关样品中分离出的3 991株酵母菌中，挑选出22株不同WL表型代表菌株进行分子鉴定。

图1 酵母菌不同WL菌落表型在新疆各地区分布矩阵图

The black notes that there is the yeast species in the area,otherwise the white notes that there is no the yeast species in the area,figure 4 same

2.2.1 序列分析结果 对22株不同表型代表菌株的5.8S-ITS区和26S rDNA D1/D2区进行序列测定分析(图2、3)，5.8S-ITS区和26S rDNA D1/D2区共同鉴定出WL1、2 的酵母菌为仙人掌有孢汉逊酵母(Hanseniasporaopuntige)；WL3、7为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，WL4为美极梅奇酵母(M.pulcherrima)；WL18为核果梅奇酵母 (Metschnikwoiafructicola)；WL20为韩国梅奇酵母(Metschnikwoiakoreensis)；WL5、15为克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)；WL6、9、12为库德毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)；WL11为陆生毕赤酵母(Pichiaterricola)；WL13、14、17、19为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporaurarum)；WL8、16 酿酒酵母(S.cerevisiae)；WL22为星状假丝酵母(Starmerellabacillaris)。WL 21通过5.8S-ITS区鉴定为伊萨陆生酵母 (Issatchenkiaterricola)；WL 10通过26S rDNA D1/D2为Methnikowiaaff。

22株代表菌中有2株仙人掌有孢汉逊酵母；2株异常威克汉姆酵母，1株美极梅奇酵母；1株核果梅奇酵母；1株韩国梅奇酵母；2株克鲁维毕赤酵母；3株库德毕赤酵母；1株陆生毕赤酵母；4株葡萄汁有孢汉逊酵母；2株酿酒酵母；1株伊萨陆生酵母；1株星状假丝酵母，共计7个属13个种(见图2、3)。

图2 基于5.8S-ITS rDNA区域序列和NJ法不同表型酵母菌和相关酵母模式菌株系统发育树

图3 基于26S rDNA D1/D2区域序列和NJ法不同表型酵母菌和相关酵母模式菌株系统发育树

2.2.2 新疆各地区菌种分布分析 综合比较分析5.8S-ITS rDNA区及26S rDNA D1/D2区测序结果，22个WL类型共属于7个属13个种，分别为仙人掌有孢汉逊酵母、异常威克汉姆酵母、克鲁维毕赤酵母、库德毕赤酵母、陆生毕赤酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、酿酒酵母、美极梅奇酵母、Metschnikowiaaff、核果梅奇酵母、韩国梅奇酵母、伊萨陆生酵母、星状假丝酵母。由表4可知，全疆3 991株葡萄酒相关酵母菌中有2 476株属于酿酒酵母,占总菌数的62%；Metschnikowiaaff、伊萨陆生酵母、星状假丝酵母菌数最少,分别为4株、4株、3株。仙人掌有孢汉逊酵母在非酿酒酵母菌中所占比例最高为64.24%。因此，新疆地区优势种属为酿酒酵母和非酿酒酵母仙人掌有孢汉逊酵母。

表4 新疆葡萄酒相关酵母菌所属种属菌株数统计表

图4 酵母菌不同种属在新疆各地区分布矩阵图

对新疆葡萄酒相关酵母7个属13个种进行采样，各地区分布矩阵分析，结果见图4。由图4可知，仙人掌有孢汉逊酵母、异常威克汉姆酵母、酿酒酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母广泛存在于新疆各地区，其中酿酒酵母存在于新疆所有采样地区。伊犁和于田地区酵母菌种类最多，达10个种；叶城地区和中信国安酒厂、乡都酒业、野果林酵母菌种类最少，仅有1种，为酿酒酵母。

3 讨 论

迄今为止，已发现的在葡萄浆果上、葡萄汁和葡萄酒中分布的酵母菌有约20个属的百余种[13]。目前，对已报道的文献统计后发现，我国新疆葡萄酒酵母资源已发现的共约20个属的53个种，统计情况见表5，其中星状假丝酵母(C.zemplinina)，又称S.bacillaris[14]；异常毕赤酵母(P.anomala)，又称异常威克汉姆酵母(W.anomala或H.anomala)[14]。由表5可见，新疆分布较为广泛的优势属是有孢汉逊酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属、梅奇酵母属、酵母属，酵母菌种数最多的属是假丝酵母属，有11种。分布最广泛的菌种是常见的葡萄汁有孢汉逊酵母、季也蒙有孢汉逊酵母、克鲁维毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、东方伊萨酵母(现更名为P.kudriazvii[15])、美极梅奇酵母、酿酒酵母。本研究发现的7个属13个种的葡萄酒相关酵母菌中，有6个属7个种为新疆常见及分布较为广泛的酵母菌。有4个种(陆生毕赤酵母、Metschnikowiaaff、核果梅奇酵母、韩国梅奇酵母)在新疆地区首次被发现，值得进一步研究和开发。表明新疆地区葡萄酒相关酵母菌具有丰富的多样性和极大的发掘潜力。本研究对新疆本土葡萄酒相关酵母菌的种群分布特征进行了初步探究，为生产具有本土特色的葡萄酒提供菌种资源，但对于新疆各产区酵母菌的酿造特性以及利用价值还需要进一步的探讨与研究。近几年，虽然许多学者利用WL培养基鉴定葡萄酒酵母菌作为常用辅助手段，但是WL培养基的鉴定方法目前仅限于欧亚种基础上的鉴定，现仅有13类鉴别指标作为酵母菌分类的依据[12]，对于有些酵母菌尚不能精确到种，鉴定存在一定局限性，故今后的研究中还需进一步进行相关验证及完善补充。目前用于新疆酵母菌分类鉴定的培养基比较单一，对代表菌株进行分子鉴定，是一次性酵母菌鉴定出种类较少的原因。随着测序成本的降低，可利用高通量测序分析新疆葡萄与葡萄酒相关的酵母菌的多样性及菌群结构，结合可培养方法，利用多种分离培养基，调整培养参数等方法进行分类鉴定，进一步丰富菌株种类，为建立酵母菌库提供参考。

表5 新疆葡萄酒相关酵母菌

续表5

注： A：YPD表型，传统形态学，26S rDNA序列；B：WL表型、ITS-5.8S序列；C：WL表型，26S rDNA序列； D：YPD表型，26S rDNA序列

本研究对新疆境内60个县市、建设兵团13个师的565份葡萄、104份土样、33份葡萄酒厂样品中的3 991株新疆本土葡萄酒酵母菌进行了分类鉴定和多样性分析。通过WL培养基表型分类共分为22类，其中，WL1、2、3、8、19类型广泛存在于新疆各地区和酒厂内，WL 8存在于新疆所有地区及酒厂内。昌吉和伊犁地区酵母菌菌落形态最多，达18种；叶城地区和中信国安酒厂、乡都酒业、野果林的菌落形态最少，仅有1种，均为WL8。

经分子鉴定所有菌株隶属7个属13个种。其中WL1、2为仙人掌有孢汉逊酵母，WL3、7为异常威克汉姆酵母，WL5、15为克鲁维毕赤酵母，WL6、9、12为库德毕赤酵母，WL11为陆生毕赤酵母，WL13、14、17、19为葡萄汁有孢汉逊酵母，WL8、16为酿酒酵母，WL4为美极梅奇酵母，WL10为Metschnikowiaaff，WL18为核果梅奇酵母，WL20为韩国梅奇酵母，WL21为伊萨陆生酵母，WL22为星状假丝酵母。仙人掌有孢汉逊酵母为非酿酒酵母中的优势种。伊犁和于田地区酵母菌种类最多，达10个种；叶城地区和中信国安酒厂、乡都酒业、野果林等酵母菌种类最少，仅有1种，为酿酒酵母。优势种为仙人掌有孢汉逊酵母、酿酒酵母。