兔结核病模型的应用研究进展

涂振阳， 蓝常贡， 谢克恭， 陆敏安， 农 峰， 梁俊卿， 唐盛斐

(1. 右江民族医学院 研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院 附属医院脊柱骨病外科，广西 百色 533000；3. 右江民族医学院 附属医院心胸外科，广西 百色 533000；4. 广州市红十字会医院 超声诊断科，广东 广州 510235)

结核病(tuberculosis,TB)是具有强烈传染性慢性消耗性的疾病，可侵染全身多个器官。1882年德国Robert Koch发现结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)以来[1]，对MTB感染途径及TB的发病机制已有较深入的认识。1921年Calmette和Guerin研制的卡介苗(bacillus calmette guerin,BCG)首次应用于人类，BCG的普及很大程度上降低了TB新病例发生[2]。虽然TB疫苗和抗结核药物的研究取得了一定的成就，但对TB的防治仍存在局限性。这就要求我们的研究更加具有创新性和前瞻性。动物TB模型已成为国内外研究TB病理生理学、诊断学和评价治疗方案的关键模型。目前10余种动物被用于TB模型的研究，最常见的有小鼠、豚鼠、兔、恒河猕猴、食蟹猕猴等。虽然没有一种动物包括非人类灵长动物(nonhuman primates,NHP)能够完全复现人类TB的临床表现，但与啮齿动物和NHP相比，兔不仅是MTB的宿主和携带者，而且其免疫系统与人类相似度较高[3]。兔TB模型对抗结核药物和疫苗的研发以及TB发病机制的了解作出了重大贡献，是从临床前研究跨越到临床研究的重要桥梁。本文就兔免疫机制及近年来基于兔TB模型研究人类多个系统TB所取得的进展作一综述。

1 兔TB模型的特点

1.1 兔TB模型简介

MTB是胞内致病菌，其免疫机制主要是以T细胞参与为主的细胞免疫反应。通过融合吞噬体-溶酶体[4]，长期存留在巨噬细胞内。MTB是一种人畜共患的病原体，其致病特点为TB实验模型在动物种类的选择上提供更多的可能性。兔TB模型的应用历史久远，继1881年Louis Pasteur构建兔实验模型成功研发狂犬疫苗以来[5]，1882年Robert Koch首次在兔体内种植MTB，建立了真正意义上的兔TB模型[6]。1964年 Lurie[7]旨在研究先、后天防御机制对TB耐药性的作用，开创性构建耐药的兔TB模型，为进一步研究宿主对MTB感染的遗传易感性奠定了基础。随后出现了多种TB的研究模型，包括兔Pott病模型、兔骨关节TB模型、兔泌尿生殖系统TB模型以及兔消化系统TB模型等。兔TB模型将继续为揭示多种复杂的人类TB发病机制和制定更好的防治策略方面发挥重要作用。

1.2 兔TB模型相关免疫机制

对兔TB 模型免疫机制的深入研究，有助于更进一步了解兔与人类对MTB感染后免疫反应的异同点，为兔在TB模型的应用提供更多依据。MTB感染后，CD4+T细胞可分化为Th1和Th2、CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory cells,Treg)等细胞[8]，Th1细胞参与细胞迟发性超敏反应，能增强宿主对MTB的防御能力；Th2参与体液免疫应答。Th1和Th2之间免疫反应的平衡对于宿主抗MTB至关重要。Th1和Th2失衡可导致免疫功能下降，从而削弱机体抵抗感染的能力[9]。其中细胞因子如IFN-γ、IL-4、IL-13和TNF-α等发挥重大作用，这些细胞因子决定着未成熟T细胞和巨噬细胞的分化方向[10]。有研究指出，IL-4可促使未成熟T细胞向Th2方向分化，而IFN-γ可促进细胞向Th1方向分化[11]，同时巨噬细胞在IFN-γ作用下产生炎性细胞因子、趋化因子和杀菌分子。MCP-1和趋化因子配体2(C-C chemokine ligand 2,CCL2)是趋化因子家族的重要成员，且MCP-1是巨噬细胞和单核细胞趋化的重要因子[12]。常见的杀菌分子包括一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADP oxidase NOX)等，可增加巨噬细胞对MTB感染的防御能力。但实验指出，IL-4可阻止巨噬细胞活化，导致选择性活化吞噬细胞的产生，进而增加精氨酸酶-1(arginase-1 ARG1)和过氧化物酶体增殖激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPAR-γ)等免疫介质，同时减少iNOS的表达，故在感染早期降低宿主巨噬细胞对MTB控制效率[13]。Treg是一种特殊类型的免疫抑制细胞，在感染MTB时，高水平的TGF-β可以促进Treg的分化，使效应T细胞的免疫功能受到极大的抑制。研究证实MCP-1和TGF-β的高表达与宿主免疫功能下降密切相关[14]。Subbian等[15]对兔TB免疫反应进行分析时发现，感染后4周肺部的MTB成倍繁殖，并在12周内保持高负荷状态，于16周肺结核空洞逐渐形成。同时发现IFN-γ和IL-4在整个过程逐渐增加，在12到16周达到高水平，此研究为兔TB在不同免疫反应阶段的病理特征作出详述，为进一步研究提供可实验依据；Guo等[16]发现兔TB外周血中MCP-1和NF-κβ表达水平处于较高状态，因此推断宿主早期通过先天性免疫反应及T细胞的活化抗MTB感染，这与人类抗结核免疫反应表现出高度的一致性。

1.3 兔TB模型的优势和局限性

动物模型已成为模仿人类传染病并研究该疾病的重要途径。目前用于构建TB模型的动物主要包括啮齿、NHP以及兔等。但因不同模型之间在易感性和病理反应方面存在着一定的差异，故不同的动物TB模型各具优势和局限性。兔不仅可以携带MTB，还是MTB 的宿主，与人类TB病理反应相似度较高。因兔体型介于啮齿动物和非人类灵长动物之间，且具有再现性好、动物背景资料完整、复制率高和专一性好等优点。尽管兔TB模型是重要、可靠的动物模型，但仍存在一定的局限性，面临众多挑战，如TB动物实验要求在生物安全三级(Animal biosafety level-3,ABSL-3)实验室内进行，很大程度上限制了兔TB模型的广泛开展；同时兔TB模型缺乏相关免疫试剂，阻碍了兔TB模型的多样化研究。

2 兔TB模型的应用价值

2.1 兔TB模型在抗结核药物中的应用价值

2.1.1 抗结核药物及其相关机制 抗结核药物的研制对降低TB发病率具有重大意义，目前常见的一线抗结核药物[17]主要包括异烟肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RFP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)等，而对氨基水杨酸、对氨基水杨酸异烟肼、环丝氨酸、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、特列齐酮等主要作为二线抗结核药物用于临床。由于TB的广泛耐药、耐多药的出现，严重降低了抗结核药物的疗效。统计发现，约20%的MTB至少对其中一种抗结核药物具有耐药性，而且耐多药TB的发病率有上升趋势[18]。耐药的出现可能与长时间使用抗结核药物以及基因多态性等因素有关。如何充分利用兔TB模型作为研究载体，将现有抗结核药物的疗效最大化并缩短治疗时间，从而避免耐药TB 的产生，是目前研究的重点之一。1951年INH开始用于临床治疗TB，其作用机制是阻止MTB与核酸的结合，然而长期服用INH可导致耐药的产生。研究发现，MTB中katG基因突变是INH的耐药机制之一[19]。1972年RFP用于抗结核治疗，主要通过抑制MTB的RNA多聚酶从而阻止mRNA 的合成[20]。一旦形成耐药，可同时伴有异烟肼耐药的出现。PZA生成吡嗪酸后抑制结核分枝杆菌脱氢酶杀菌[21]，20世纪70年代，随着PZA的临床应用，治疗时间大为缩短，但迄今为止PZA在TB的治疗机制上仍存在一定争议。EMB主要作用于阿拉伯糖基转移酶并影响细胞壁的形成，常用于抑制繁殖期的MTB感染,有报道指出谷氨酸外消旋酶作为EMB的一个靶点，是MTB在I期肽聚糖生物合成途径的关键酶[22]。了解现有药物的作用机理和作用位点为抗结核实验研究指明了方向。

2.1.2 兔TB模型在抗结核药物中的应用进展 如何避免耐药TB的出现并将抗结核药物疗效最大化，是TB治疗的研究重点。戈朝辉等[23]利用新西兰大白兔脊柱TB模型，发现INH、RFP白蛋白纳米粒与INH、RFP普通制剂相比具有良好的体内缓释型，在兔TB模型的治疗效果中前者显著优于后者。兔TB模型还可用于评价脂肪间充质干细胞与RFP缓释微球复合物的疗效，结果显示该复合物可有效抑制MTB生长，减少椎体骨质破坏[24]。Blanc等[25]利用兔TB模型证明PZA可有效杀死病灶中的MTB，且治疗2个月后抗结核强度较前明显加大。虽然临床通过药代动力学检验证明，EMB的抗结核的应用价值有限，但Zimmerman等[26]通过兔TB模型分析时发现，EMB对结核病灶的穿透性较强，而抗结核药物对病灶的穿透性也是抗结核药物研发的重点项目之一。由于耐药的TB患者长期使用抗结核药物，可能因肉芽肿低氧微环境导致病灶高度纤维化，因此药物对肉芽肿渗透差，Datta等[27]构建TB模型，运用抗血管内皮细胞生长因子治疗MTB破坏脉管系统的兔TB模型，并检测低分子量示踪剂在肉芽肿周围的分布，发现未经治疗的人类和兔TB肉芽肿中血管内皮细胞覆盖率较低，经抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗治疗TB感染家兔，贝伐单抗治疗促进了结核肉芽肿血管正常化，改善小分子传递，减少缺氧，从而为改善当前治疗方案在疗效上提供了一个潜在的途径。对MTB感染风险分析发现，治疗慢性炎性疾病和使用TNF-α拮抗剂等可增加患TB的风险。Tsenova等[28]研究结果证实了以上观点。此实验证明兔TB模型对人类免疫调节试剂的研究具有可行性。故兔TB模型的应用很大程度上提高了对TB发病机制的认识，同时提高了现有抗结核药物的治疗水平。

2.2 兔TB模型在疫苗评价中的价值

2.2.1 TB疫苗 疫苗是经过诱导宿主产生免疫，保护人类和动物免受传染病和非传染病侵害的最有效的方法之一。TB疫苗的使用很大程度上降低了TB扩散蔓延。但疫苗的研制多数尚处于临床前和临床开发阶段，目前疫苗的研发[29]包括基础性免疫疫苗VPM1002和MTBVAC；增强性免疫疫苗如亚单位疫苗Hybrid1-IC31、Hybrid1-CAF01、H56、IC31、H4、LT70、M72和D93；病毒载体疫苗如修饰痘病毒 Ankara株(modified vaccine virus Ankara MVA)；全细胞疫苗如DAR-901；疫苗免疫佐剂如IC31和AS01E；治疗性疫苗如Ruti和SRL-172。但被允许广泛应用于临床预防TB是法国科学家近100年前研制的减毒活疫苗BCG，全世界范围内约40亿人已接种BCG，覆盖率高达90%[30]，但该疫苗并不能完全杜绝TB，对有效新疫苗的研发仍有很大的提升空间。

2.2.2 兔TB模型在TB疫苗中的应用进展 动物模型对于疫苗的评价和开发是必不可少的。目前已有超过35种动物被用于1 300余种疫苗的实验测试[31]，但是利用动物模型进行疫苗研究仍存在种种挑战，动物模型的选择也是疫苗研制者争论的焦点之一。人们一直以来尝试建立多种不同动物模型来测试候选疫苗，但每种动物模型都无法完全复制疾病在人类发生的特征。虽然NHP和牛与人类抗结核的免疫机制十分接近，但鉴于成本高昂、饲养条件苛刻，因此容易受样本数量的限制；豚鼠和小鼠等啮齿动物是研究多种疾病疫苗最常用的动物模型，然而在对MTB感染后免疫过程的观察中发现，豚鼠产生免疫反应较弱，而小鼠产生迟发性超敏反应，难以复制人类TB的临床表现。家兔作为动物模型优于啮齿动物，兔TB模型能够形成类似于人类的干酪样坏死和空洞，可用于多种结核疫苗的研究。基础性免疫疫苗VPM1002最初是为了提高MTB抗原参与MHC I通路，通过李斯特菌溶胞素(listeriolysin O，LLO)微扰吞噬体膜介导的抗原胞质向外转移，从而提高BCG株诱导CD8+T细胞的能力。此外，组织蛋白酶等吞噬溶酶体蛋白酶泄漏到细胞质能够激活凋亡蛋白酶，导致细胞凋亡和随后MTB抗原的交叉表达，促进MHC I和MHC II限制性T细胞表达[32]。Velmurugan等[33]对VPM1002和BCG的安全性进行了比较，通过构建幼兔TB模型，复制婴幼儿对VPM1002反应，证实VPM1002的临床前安全性。Chen等[34]进行TB疫苗LT70研究时，设置了一种BCG试验性给药兔皮肤TB模型，发现亚单位疫苗LT70和 EAMM-MH联合应用在兔皮肤TB模型中显示出良好的保护效果，为TB疫苗评价提供了一种直观、简便的新模型。另外一项研究，Li等[35]建立了兔肺卡介苗潜伏期感染模型，LT70亚单位疫苗在MTB潜伏期或增殖期的相关抗原结果显示出比传统疫苗更好的治疗效果。Liu等[36]用其他动物建立TB模型，实验结论与LI一致，证明兔试验模型可靠。兔TB模型是疫苗研制的重要动物模型，针对不同实验目的，设计可准确检测疫苗有效性的多样化兔TB模型是研制TB疫苗的重要环节。

2.3 兔TB模型在Pott病中的应用进展

Pott病[37]是MTB入侵易感人群后累及脊柱和神经的疾病,发病率约占骨关节TB的50%,若不及时治疗或治疗不当可能导致椎体骨质破坏、脊柱畸形, 甚至脊髓受压亦或重度感染危及生命。研究发现，Pott病神经系统受累的发生率约为10%～47%[38]，是主要威胁全球公共卫生的疾病之一。因此充分合理利用现有动物模型，深入研究MTB诱发Pott病的发病机制具有重要意义。不同的MTB菌种、浓度的配置、手术入路均可对实验结果产生重大影响。用于构建兔Pott病模型的MTB主要包括强毒型菌株H37Rv，减毒型或无毒性菌株H37Rva、Erdman、北京家族、马来西亚菌株。在造模过程中若MTB悬液浓度过高容易导致兔中毒死亡，浓度过低可因未感染而导致造模失败。H37Rv最初分离于H37，用于构建兔Pott病模型的常用浓度为5 mg/mL，注射量为0.2 mL，第4～6腰椎常作为感染部位，随着病程发展可形成包括肉芽肿等类似人类TB的病理特征。Liu等[39]在研究通过将H37Rv植入新西兰白兔的腰椎，建立兔Pott病模型时，测得造模成功率为68.1%，与Geng等[40]造模成功率89.5%相比具有差异性，可能与兔样本量、菌株种植部位不同及兔饲养环境等有关。

兔Pott病模型在治疗上同样作用意义重大，Wang等[41]研究发现，在新西兰大白兔TB模型中，异奎硫原蛋白可通过抑制免疫反应有效缓解脊柱TB。病灶清除植骨融合内固定术是目前Pott病的外科治疗方式，内固定植入人体后，MTB可依靠自身特有结构，同时分泌细胞外多黏质物质(extracellular slime substance,ESS)，通过与细胞外基质共同形成生物膜并不断繁殖，形成耐药，导致术后复发。因此通过兔Pott病模型进行内固定材料的筛选，寻找更多的临床内固定材料，为Pott病成功治疗提供保障。孙厚杰等[42]利用兔Pott病模型对钛金属材料和 n-HA/PA66人工材料进行比较，发现后者表面黏附菌量明显增多，故推测作为植入材料，钛金属材料优于n-HA/PA66。同样兔脊柱结核模型还可用于Pott病的术后护理研究及影像学研究[43]，更加丰富了兔结核模型对Pott病的诊治内容。

2.4 在其他疾病的应用进展

MTB感染创面是结核杆菌侵犯织皮肤软组织所致，治疗不当容易导致病区迁延不愈。Zhang等[44]构建了新西兰兔MTB感染创面模型，探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对创面清创后愈合的影响，发现bFGF可单独或联合抗结核药物促进创面愈合，且效果显著优于单独使用抗结核药物。膀胱TB常因结核分枝杆菌刺激使膀胱收缩导致容量减少，最后发展为完全闭塞，是膀胱切除术的指征之一。若及时发现，早期规律用药可以恢复膀胱功能，避免膀胱切除。兔TB模型可为膀胱结核病的治疗提供实验依据，Yudintceva等[45]以新西兰兔膀胱结核模型为研究对象，采用自体骨间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)评价膀胱功能恢复的疗效，证实向膀胱黏膜层给予MSCs可显著减少膀胱壁的变形和炎症，并抑制纤维化，促进干细胞在膀胱内再生，丰富了膀胱TB临床治疗方式。中枢神经系统TB是最严重的一种肺外结核病，对儿童的影响尤为严重。建立一种具有儿童结核性脑膜炎特征的兔模型，不仅可用于评估神经功能障碍、细菌菌量、死后微生物学和病理学变化，还可为诊治结核性脑膜炎与儿童大脑发育相关疾病提供新的方法[46]。同时，兔还可以胜任包括生殖系统以及消化系统TB等多种不同系统的动物模型，为TB的诊治提供更广阔的思路。

3 展 望

目前动物TB模型的构建已成为TB防治工作的重要部分，但由于MTB是人畜共患的病原体，结核菌株可在动物间传播，甚至可感染人群，所以构建动物TB模型对实验室生物安全的级别要求较高，阻碍了兔TB模型的广泛构建。因此研发新型结核菌株在种植兔后不仅在病理表现上与人类高度一致，且在动物间或人畜间无传播性是当前研究的重点内容之一。不同菌株浓度和不同种植途径均可影响模型构建的成功率，建立兔TB模型评价标准，有助于提高实验成功率，优化兔TB模型。随着基因组学和蛋白质组学技术的应用，有望构建结核易感的兔TB模型来弥补现有模型缺陷，达到快速评估和制定可靠的治疗方案的目的，为临床实验节省宝贵的时间和经费支出，为TB的防治提供新的技术。