副溶血性弧菌在动态体外人胃仿生原位消化系统中的存活情况研究

王思琦， 张昭寰， 刘海泉,2,3,4， 潘迎捷,2,3， 赵 勇,2,3*

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3. 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)，上海 201306； 4.上海海洋大学 食品热加工工程技术研究中心，上海 201306)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种常见的食源性病原菌，是沿海地区夏秋季引发食物中毒的重要病原菌之一，对公众健康构成了极大威胁[1]。副溶血性弧菌会引起人体急性胃肠炎，具有腹痛腹泻、呕吐恶心、发烧等临床症状，通常与食用了生的或未煮熟的海鲜密切相关[2]。该菌最适生长温度为35～37 ℃，最适生长pH值为7.5～8.5，对酸敏感，在pH值低于6的酸性条件下一般不生长[3]。由于科研条件及道德伦理等方面的限制，往往无法直接对人体消化道进行研究[4]，因此，副溶血性弧菌进入人胃后的存活情况尚属研究空白，难以解释其通过强酸性胃液而导致人体患病的根本原因。目前，可替代活体实验的人工模拟胃肠道模型主要分为两类：人工模拟胃肠道静态模型及人工模拟胃肠道动态模型。Mao等[5]使用人工模拟胃肠道静态模型对大肠埃希菌的存活进行了研究，2014年Minekus等[6]提出了此类模型的标准化“黄金模型”，该模型操作简便且重复性良好，但无法模拟胃肠道消化的动态过程，与实际情况仍存在一定差距。人工模拟胃肠道动态模型主要有四种：1993年比利时根特大学Molly等[7]构建的SHIME模型(Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem)、1996年荷兰应用科学研究组织Minekus等[8]构建的TIM模型(TNO Intestinal Model)、2015年马德里自治大学Barroso等[9]构建的SIMGI模型(Simulator of the Gastro-Intestinal tract)及2018年苏州大学陈晓东等[10]构建的DHSI-IV模型(Dymanic Human Stomach Intestine)。DHSI-IV模型是一种形态学、动力学、胃肠环境高度仿生的“准真实”体外消化模型，该模型在未来对临床、食品、药品开发及应用等领域具有一定的助力作用。胃是人体消化道中最为极端的环境，是盐酸(HCl)分泌的主要部位，空腹胃液pH值在1.0～3.0，是在食物或饮用水中病原菌进入肠道之前杀死或灭活病原菌的主要场所。而副溶血性弧菌这一不耐酸性病原菌，在pH值为3.0的酸中处理15 min不能存活[11]，关于其如何通过人胃这一极端环境方面的研究基本空白。本研究针对这一问题，创新性地运用DHSI-IV模型，以三文鱼和南美白对虾为食物基质接种副溶血性弧菌后，对真实胃部消化过程中的食糜排空、胃部pH值变化及接种后的细菌存活情况进行研究，以期后续以此为基础建立一个标准化消化模型，进一步揭示副溶血性弧菌在人体消化道中的耐受性及致病机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 南美白对虾、三文鱼购自上海市浦东区农贸市场。

1.1.2 菌株 副溶血性弧菌VPD58，本实验室环境分离菌株，携带种特异基因tlh和毒力基因tdh。

1.1.3 培养基 TCBS琼脂培养基(硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基，北京陆桥技术有限责任公司)，PW(Peptone water，添加0.85% NaCl及0.1%蛋白胨，北京陆桥技术有限责任公司)，TSB液体培养基(胰酪大豆胨液体培养基，添加3% NaCl，北京陆桥技术有限责任公司)，TSA琼脂培养基(胰蛋白胨大豆琼脂培养基，北京陆桥技术有限责任公司)

1.1.4 试剂与仪器 KCl、KH2PO4、NaHCO3、NaCl、MgCl2·6H2O、(NH4)2CO3、CaCl2·2H2O(分析纯，Sigma)，猪胃黏膜胃蛋白酶(≥250 U/mg，Sigma公司)，CombiMax K600料理机(法国interscience公司)；Eppendorf离心机(德国Ep-pendorf公司)；高精度恒温培养箱(日本Sanyan公司)；Bio-Tek酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；动态体外人胃仿生原位消化系统(苏州晓东宜健公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备 将三文鱼和虾样品放入热水中煮沸20 min，在生物安全柜中冷却后，称取150 g左右的样品，加入20 mL无菌水，用灭菌处理后的料理机，1 500 r/min处理，制备吞咽后的样品状态。另取10 g灭菌样品，均质涂布于TSA培养基上，过夜培养，如无菌落生长，证明样品已经去除背景微生物。

1.2.2 细菌悬浮液制备和接种 将副溶血性弧菌VPD58划线接种至TCBS平板，挑取单菌落至9 mL TSB(3%NaCl)试管中，180 r/min、37 ℃摇床培养10～12 h，连续活化2次。将培养后的菌液离心10 min(3 600 r/min，25 ℃)，去掉上清液，用PW溶液调节OD600至1.2左右，吸取1.6 mL菌液接种于制备好的样品中，初始接种量7.0 Lg(cfu/g)。

1.2.3 模拟胃液(SGF)的制备 参照Minekua方法配制并经0.22 μm滤膜除菌[6]。模拟胃液储备液(见表1)，配制后4 ℃备用。模拟胃液用127.5 mL储备液，以储备液为溶剂的浓度为25 000 U/mL的胃蛋白酶溶液27.2 mL，85 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液，用无菌水定容至170 mL，并用HCl溶液调节pH值至1.6，现配现用。

表1 模拟胃液储备溶液的制备

注：a由于钙可能发生沉淀，因此将CaCl2·2H2O直接添加到模拟消化液和食物的最终混合物中;“-”表示模拟消化液对CaCl2·2H2O的使用体积不做要求，最终浓度达到0.075 mmol/L即可

1.2.4 动态体外人胃仿生原位消化系统及设定 动态体外人胃仿生原位消化系统(DHSI-IV模型)包括仿生食道组件及仿生胃组件(图1)。仿生胃组件包括3D打印硅胶仿生人胃(图2)，包括胃袋上的幽门和贲门、以偏心轮为主的滚动挤压装置、与胃袋相通的胃液管及温控装置。仿生人胃是按照真实人胃进行3D打印，是典型的“J”形。硅酮皮的厚度为(6.0±1.6) mm，具有良好的弹性和机械耐受性，允许反复挤压而不撕裂，人体胃部模型的内部体积约为500 mL。此外，该模型的内腔有褶皱，两根硅胶管(内径1.5 mm，外径2 mm)连接到胃体，模拟胃分泌腺的作用。管子的另一端嵌入一个连接器(内径10 mm，外径16 mm)，并安装了一组单向阀，阀门是用来防止胃里的东西回到分泌管内。用蠕动泵将人工胃液打入分泌管。该装置的各类参数设定见表2，温度维持在正常人体温37 ℃，模拟胃液的输入速率见图3。

图1 动态体外仿生原位消化系统

图2 3D打印胃模型剖面图

图3 模拟胃液输入速率

表2 动态体外人胃仿生原位消化系统参数

注：“-”表示对该项参数不存在

1.2.5 存活率的计算 收集胃排出的食糜，利用平板涂布方法计算菌落数，并根据公式：细菌存活率=瞬时细菌菌落数(cfu/g或cfu/mL)/初始接种菌落数(cfu/g或cfu/mL)，计算细菌存活率[12-13]。

1.2.6 数据处理 使用SPSS软件(version 19.0, SPSS Inc., Chicago, IL)对数据进行统计分析，以平均值±标准差表示，显著性检验采用ANOVA方法分析。

2 结果与分析

2.1 DHSI-IV模型中的食糜排空

如图4所示，在动态体外人胃仿生原位消化系统中，模拟消化虾或三文鱼0～30 min时，几乎没有食糜排出，三文鱼的食糜排出量在60～90 min到达峰值(79.85±0.35) mL，而虾在90～120 min到达峰值(123.00±3.00) mL。在消化120 min后，仍有(98±2.93) mL三文鱼糜-胃液混合物和(192±5.19) mL虾糜-胃液混合物未排出。

2.2 DHSI-IV模型中胃排空出食物pH值的变化

在120 min的消化模拟过程中，动态体外人胃仿生原位消化系统中胃部pH值的变化如图5所示。由于食物的稀释作用，在食物进入体外人胃模型的前10 min，pH值从1.60迅速增高至7.30(虾)和6.40(三文鱼)。随着胃液的不断分泌以及食物的排空，胃部的酸碱度不断缓慢降低。其中在90～120 min，模拟消化虾的胃部pH值降低趋势强于模拟消化三文鱼，与食糜排空的过程同步。在120 min时，消化两种水产品的胃部pH值均在5.40左右。

图4 幽门末端的食物残渣排出量

图5 DHSI-IV model模拟胃部消化南美白对虾及三文鱼过程中的pH值变化

2.3 DHSI-IV模型模拟消化三文鱼时细菌浓度的变化

收集幽门排出的三文鱼食糜后进行TCBS平板涂布菌落计数，结果如图6所示，存活率见表3，随着模拟消化时间的不断增加，三文鱼中副溶血性弧菌的细菌浓度呈明显下降趋势， 10 min时三文鱼中细菌浓度为(4.395±0.115) Lg(cfu/mL)，存活率为(0.248±0.012)%；120 min时，细菌浓度为(2.865±0.175) Lg(cfu/mL)，存活率为(0.007±0.005)%，0～10 min副溶血性弧菌细菌浓度下降趋势最大，见表4。

图6 体外消化过程中接种在三文鱼糜中副溶血性弧菌细菌浓度变化

表3 体外消化过程中三文鱼糜中副溶血性弧菌的存活率

2.4 DHSI-IV模型模拟消化南美白对虾时细菌浓度的变化

收集幽门排出的南美白对虾食糜后进行TCBS平板涂布计数，结果见图7，存活率见表3，随着模拟消化时间的不断增加，三文鱼中的副溶血性弧菌细菌浓度数值呈明显下降趋势， 10 min时三文鱼中细菌浓度为(6.107±0.075) Lg(cfu/mL)，存活率为(13.490±0.011)%;120 min时，细菌浓度为(4.219±0.078) Lg(cfu/mL)，存活率为(0.119±0.025)%;20～30 min副溶血性弧菌细菌浓度下降趋势最大，见表4。

图7 体外消化过程中接种在南美白对虾糜中副溶血性弧菌细菌浓度变化

表4 体外消化过程中南美白对虾糜中副溶血性弧菌的存活率

3 讨 论

胃的消化过程是一个物理和化学作用结合的过程。分解被摄取的物质，同时清空小颗粒和液体，这一过程被称为胃排空[14]。Bornhorst等[15]报道不同种类的米(精米和糙米)在猪模型中的胃排空速率，Johansen等[16]测定了装有胃插管的猪(以小麦和燕麦为基础的饲料)的胃排空淀粉情况，均发现淀粉具有相似的排空率。但本研究得出的不同蛋白质食物的胃排空速率则并不相似，蛋白质的排空可能不同于食物中淀粉的排空。胃中食物分解率在决定胃排空和营养吸收等其他过程中起着关键作用，但其规律目前还不完全清楚[17]。由于胃形态的“J”形特征，食物混合物会在体外胃模型中分层，胃中“食物”的排空过程会出现一个滞后的过程[18]。Collins等[19]利用志愿者研究了葡萄糖-碎牛肉-鸡肝混合物组成的食物的胃排空，其滞后时间在56 min。本研究结果表明三文鱼排空的滞后期在0～30 min，而南美白对虾的滞后期长达90 min。滞后阶段是高度个人化的，在一些人体研究中，有些受试者的滞后阶段可能长达90 min[20]。这一食糜的排空峰值出现的差异，不仅与胃液的分泌相关，与食物种类相关、还与食物的卡路里[21]、食物成分[22]有关。

胃液中的酸具有水解碳水化合物、激活胃蛋白酶、提供适宜的反应环境的功能[23]。本研究中在食物摄入DHSI-IV模型后的前10 min内，pH值的变化表明了三文鱼和南美白对虾对胃酸的缓冲作用，这一缓冲作用在其他体内研究中也有同样的发现：在进食后半小时内胃部pH值快速升高后，人体往往需要2～4 h将胃部pH值降低到初始值[24-25]。副溶血性弧菌在人体消化道的存活是其致病机制的关键，本研究数据表明，在食品消化120 min进入肠道后，副溶血性弧菌并没有完全被胃酸杀灭，对虾中该菌的存活率为(0.119±0.025)%，而三文鱼中存活率为(0.007±0.005)%。与三文鱼相比，对虾中的副溶血性弧菌能更好的通过胃部到达肠道。导致这一现象的原因可能是副溶血性弧菌随食品摄入后，食物基质导致胃酸大幅升高，从而使副溶血性弧菌能够免遭胃液的杀灭，并通过胃排空进入肠道，而导致人体致病。

综上所述，本研究运用DHSI-IV模型模拟并描述了食物中的副溶血性弧菌在人胃中的存活情况：在消化早期，随着食物的消化分解，胃部pH值不断升高，使得副溶血性弧菌这一不耐酸的致病菌能够避免胃液的杀灭作用，通过胃排空进入肠道而引起致病。但由于人体消化是一个十分复杂的过程，且消化过程还涉及一系列复杂的神经调控和免疫应激，并且不同人群、不同食物、不同饮食习惯等状况均易产生不同的消化行为。因此，后续研究将进一步通过大量试验来收集数据，开发设计出一种更接近真实人体消化的理想模型，为对副溶血性弧菌致病机制的揭示、微生物风险评估、副溶血性弧菌的治疗和疫苗的开发提供强有力的科研工具。