水稻细菌性条斑病发生对水稻根际土壤微生物群落碳代谢多样性的影响

杨 俊， 王 星， 王彦芳， 张荣琴， 代真林， 呼宝健， 陈秀琼， 姬广海， 魏兰芳

(1.云南农业大学 生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201；2.云南农业大学农科基础实验教学中心，云南 昆明 650201；3.朋普镇农业综合服务中心，云南 弥勒 652399)

植物在土壤中生长，直接与丰富多样的微生物接触，植物和微生物之间经过长时间的协同进化，会形成一个互利共生的微环境[1]。根际微生物是从根际分离所得，有研究报道内生微生物来源于根际，并从根际进入植物组织内部[2-3]。有益的根际微生物还能促进植物的能量代谢，提高寄主的抗病、抗逆性和合成促进植物生长的激素[4-6]。当前，越来越多的研究已经不局限于水稻地上部分植物农业性状单一的改良，而是发展到地下土壤微生物群落结构、功能的分析[7]。前人研究发现植物的根际微生物受植物的品种和种植土壤环境的影响。Peiffer等[8]通过高通量测序技术发现美国不同地理位置和品种的玉米根际微生物群落结构受地理环境的影响较大而受品种的影响较小。Shakya等[9]发现不同生长状态和地理位置对杨树根际微生物都有影响。Edwards等[10]在温室控制条件下，发现水稻微生物群落组成随土壤来源和品种基因型的不同而有所差异。水稻是世界上重要的粮食作物，尤其是在亚洲。水稻细菌性条斑病是由水稻黄单胞属(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)细菌通过气孔或者伤口入侵寄主植物，定殖于水稻叶片的薄壁组织细胞间并扩展形成病斑，病斑不断融聚导致全叶枯死[11]。近年来，随着农业种植环境的改变和生产中没有有效的抗性品种，水稻细菌性条斑病形成的危害越来越严重，在中国条斑病引起的水稻减产云南西部稻区已经达到40%[12]。水稻条斑病、水稻细菌性条斑病从苗期到抽穗期都会发生，但以分蘖期到抽穗前期发病为多，发病以后，严重时影响灌浆，秕粒增多引起减产[13]。至今鲜有研究报道水稻条斑病菌入侵水稻叶片后，水稻根际微生物群落碳源代谢功能多样性的变化。本研究采用Biolog微平板技术对田间水稻在条斑病未发病期(健康期)和病害发生期(发病期)的根际土壤微生物群落碳源代谢多样性的变化动态进行分析，以期揭示不同水稻发生条斑病病理期土壤微生物群落功能多样性的变化规律，为水稻条斑病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 水稻材料 水稻CG2和IR24，CG2为云南地方水稻材料，前期实验室抗性评价为抗条斑病材料；IR24 (亲本来源：IR8♀, IR127-2-2♂, 籼型常规水稻)为水稻条斑病感病品种；日本晴：田间水稻抗性评价的感病对照材料。参试材料种植于云南省红河哈尼族彝族自治州弥勒市朋普镇水稻实验田(北纬N23°57′36.59″，东经E103°21′38.71″，海拔：837 m)，试验田采用小区设计，共 6 个小区(每个品种各3个小区，按照单因素随机区组设计)，每个小区为单一水稻品种，小区内水稻种植呈3行10列，行间距25 cm，列宽20 cm。移栽时间为2017年5月15日。

1.1.2 土样采集 采集时间分别为2017年6月29日和8月10日，水稻处于分蘖期和孕穗期(分蘖期水稻田间未发现任何条斑病害作为健康期的采样，而孕穗期田间水稻条斑病害爆发作为发病期采样)，每个小区采用五点采样法。采集时掘取整株水稻，水稻根部土壤掘取至少15 cm的深度，保持整个根系的完整，轻轻抖落根系表面的大块土壤，收集附着在根系上的土壤作为根际土壤，采集后立即将水稻带回实验后收集根际土壤。水稻CG2品种分蘖期根际土壤编号为 “CG2-1”，孕穗期根际土壤编号 “CG2-2”；水稻IR24品种分蘖期根际土壤编号为 “IR24-1”，孕穗期根际土壤编号 “IR24-2”。收集完成4 ℃保存[14]。

1.1.3 仪器与设备 采样箱为沃之沃塑料收纳箱(长70 cm×宽57.5 cm×高50 cm)购自云南沃尔玛百货有限公司；胶体冰袋(100 mm×155 mm，热容332 KJ/Kg)购自北京海科森科技有限公司；Biolog 全自动微生物鉴定系统(Gen III Microstation型)和Biolog ECO微平板(Biolog ECO plate，Cat NO.1506)购自美国Biolog公司。28 ℃培养箱为 Boxun 隔水式恒温培养箱(GSP-9160MEB型)购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2 方法

1.2.1 田间水稻条斑病病情调查与统计 水稻孕穗期，待感病对照品种日本晴发病稳定(即叶片病斑长度不再扩展)，随机测量各品种每个小区20片剑叶的全叶长及其病斑长度，依据病斑占据叶片百分率进行抗感性分级，分级标准：0级(高抗，HR)，叶片健康无病斑；1级(抗病，R)，病斑占据叶片百分率为5%～15%；3级(中抗，MR)，病斑占据叶片百分率为 16%～30%；5级(中感，MS)，病斑占据叶片百分率为 16%～30%；7级(感病，S)，病斑占据叶片百分率为 31%～50%；9级(高感，HS)，病斑占据叶片百分率>50%。根据以下公式计算各处理的发病率、病情指数。

发病率：病株率(%)=(发病总株数/调查总株数)×100%

病情指数：病指=∑(各级病叶数×相对级数值)×100 /(调查总叶数×9)

1.2.2 根际土壤微生物活性测定及其数据分析 根际微生物代谢功能多样性采用Biolog-ECO (31种碳源) 进行分析测定。Biolog ECO微平板中具有 6类碳源，共 31 种，各孔碳源包括糖类 10 种，氨基酸类 6 种，羧酸类 7 种，多聚物类 4 种，酚酸类 2 种，胺类化合物 2 种，酚类 2 种。称取10.0 g土壤加入90 mL无菌生理盐水(0.85%)溶液中,28 ℃ 120 r/min摇床振荡30 min, 4 ℃冰箱静置10 min, 待分层稳定取上清液梯度稀释10-3, 取150 μL稀释液至 Biolog-ECO 板的微孔中, 接种好的平板置于25 ℃恒温培养，分别于24、48、72、96、120、144、168 h在Biolog EmaxTM 自动读盘机上用 Biolog Reader 4.2软件(Biolog, Hayward, CA, USA)读取OD590 nm值[15]。采用培养 72 h 的数据进行土壤微生物碳源利用分析和主成分分析，微生物多样性指数分析采用EXCEL2010, 根际微生物群落的Shannon多样性指数(H′)，Shannon均匀度指数(SE)，Simpson指数(D)，McIntos指数(U)和McIntosh均匀度指数(ME)的计算方法[16]见(表1)，其中Pi为第i孔的相对吸光值(C-R)与整个平板相对吸光值总和的比率；S为颜色变化的孔的数目；ni是第i孔的相对吸光值(C-R)；N是相对吸光值总和。采用软件PAST进行主成分分析，各碳源利用情况的热力图使用MetaboAnalyst 3.0 在线生成,其中聚类方法中样本归类距离为欧氏距离 Euclidean。

表1 微生物群落多样性指数计算方法

Table 1 Microbial community diversity index calculation method

多样性指数计算方法Shanon 多样性指数H'=-∑Pi (lnPi)Shanon 均匀度指数E= H'/lnSSimpson多样性指数D=∑(ni(ni-1))(N(N-1))McIntosh多样性指数U=(∑ni2)McIntosh均匀度指数E=N-UN-N/s

2 结果与分析

2.1 不同水稻品种的条斑病抗性评价

对两个水稻品种的条斑病抗性评价结果表明，两个水稻品种在水稻孕穗期的抗性评价结果存在明显差异，处于孕穗期水稻品种CG2对水稻条斑病表现为抗病，而水稻品种IR24则表现为感病(表2)。病斑长度、病斑占叶片百分比和病情指数三个指标均存在显著差异，感病品种IR24相对抗病品种CG2分别高出60.26%、65.08%和75.84%。由此水稻品种CG2和IR24可以作为抗病、感病品种的研究材料进行水稻根际土壤微生物群落碳代谢多样性分析。

表2 不同水稻品种对条斑病的田间抗性评价

注: 同列数据后不同字母分别代表两个品种在P< 0.05 水平下差异显著

2.2 不同水稻品种和病理期根际土壤微生物对碳源的利用特征

AWCD值(对总碳源的利用强度)变现为对总碳源的利用能力，对总碳源的利用能力大，是对微生物活性及群落功能多样性的重要指标, 值越大表明土壤微生物密度越大。由图1可知，两个水稻品种不同病理期的根际土壤微生物的AWCD值随着培养时间的延长而增加，培养到72 h后趋于稳定。不同水稻品种相同病理期的根际土壤微生物群落的AWCD值变化差异明显，培养72 h时，健康期的水稻品种CG2的AWCD值比水稻品种IR24增加了33.84%；发病期的水稻品种CG2的AWCD值比IR24增加了19.86%。不同生理期水稻品种CG2根际土壤微生物对总碳源的利用能力高于品种IR24。

同一品种在不同病理期的根际土壤微生物对碳源的利用情况也有差异，水稻品种CG2健康期的根际土壤微生物对总碳源的利用强度比发病期的高，培养72 h时，健康期的根际土壤微生物的AWCD值比发病期的高出69.62%；水稻品种IR24健康期的根际土壤微生物对总碳源的利用强度同样高于发病期，培养72 h，健康期的根际土壤微生物的AWCD值比发病期的高出96.63%。

图1 不同病理期根际土壤微生物AWCD值的变化情况

2.3 根际土壤微生物群落功能多样性指数的变化

不同的多样性指数可以表示土壤微生物群落利用碳源类型的情况。Shannon多样性指数(H′)评估丰富度；Simpson多样性指数(D)评估某些最常见种的优势度指数；McIntosh指数(U)基于群落物种多维空间上的Euclidian距离的多样性指数，由McIntosh指数计算得出的均匀度。对培养 72 h 各类型的土壤进行测定，计算各品种根际微生物代谢功能多样性指数(表3)。结果显示抗性差异水稻品种在不同病理期的根际土壤微生物的丰富度指数、优势度指数和均匀度指数存在差异:抗性品种 CG2健康期的根际土壤比发病期Shannon指数高7.184%、 Simpson指数高 54.568%，McIntos指数高45.792%；感病品种IR24健康期的根际土壤比发病期Shannon指数高4.646%、 Simpson指数高33.279%，McIntos指数高41.134%。其中两个水稻品种健康期和发病期根际土壤微生物的Simpson指数和McIntos指数均存在显著差异(P<0.05)。

表3 根际土壤微生物群落72 h的多样性指数

注：CG2-1:CG2分蘖期根际土壤; CG2-2:CG2孕穗期根际土壤；IR24-1:IR24分蘖期根际土壤； IR24-2:IR24孕穗期根际土壤

2.4 土壤微生物对各类型碳源利用的聚类分析

不同生理期的抗性差异水稻品种土壤根际微生物对各碳源的利用情况也存在差异(图2)。

图2 六类碳源利用强度百分比

图3 不同病理期抗性差异水稻品种根际土壤微生物对各碳源的利用情况

B1: 丙酮酸甲酯; C1: 吐温-40; D1: 吐温-80; E1: α-环式糊精; F1: 肝糖; G1: D-纤维二糖; H1: α-D-乳糖; A2: β-甲基-D-葡萄糖苷;B2: D-木糖; C2: i-赤藓糖醇; D2: D-甘露醇; E2: N-乙酰基-D-葡萄糖胺; F2: D-葡萄糖胺酸; G2: 葡萄糖-1-磷酸盐; H2: D,L-α-甘油磷酸盐; A3: D-半乳糖酸-γ-内酯; B3: D-半乳糖醛酸; C3: 2-羟基苯甲酸; D3: 4-羟基苯甲酸; E3: γ-羟基丁酸; F3: 衣康酸; G3: α-丁酮酸; H3:D-苹果酸; A4: L-精氨酸; B4: L-天冬酰胺酸; C4: L-苯基丙氨酸; D4: L-丝氨酸; E4: L-苏氨酸; F4: 葡萄糖-L-谷氨酸; G4: 苯基乙胺; H4:腐胺。CG1～3 分别代表品种CG2的 3 个重复试验小区, IR1～3 分别代表品种IR24的3 个重复试验小区

B1: Pyruvicacid methyl ester; C1: Tween-40; D1: Tween-80; E1: α-Cyclodextrin; F1: Phenylethylamine; G1: D-cellobiose; H1: α-D-lactose; A2:β-methyl-D-glucoside; B2: D-xylose; C2: i-ery-hritol; D2: D-mannitol; E2: N-acetyl-D-glucosamine; F2: D-glucosaminic acid; G2:Glu-cose-1-phosphatei; H2: D,L-α-glycerol phosphate; A3: D-galactonic acid-γ-lactone; B3: D-galactu-ronic acid; C3: 2-Hydroxy benzoicacid; D3: 4-Hydroxy benzoic acid; E3: γ-hydroxybutyric acid; F3: Itaconic acid; G3: α-ketobutyricacid; H3: D-malic acid; A4: L-arginine; B4:L-asparagine; C4: L-phenylalanine; D4: L-serine; E4: L-threonine; F4: Glycyl-L-glutamic acid; G4: Phenylethylamine; H4: Putrescine. CG 1-3 and IR1-3 are three plots of rice varieties CG2 and IR24, respectively

抗病品种CG2健康期对各类型碳源的利用强度都很相近，发病期对糖类、酯类和胺类利用强度较高，分别是19.249%、19.250% 和21.328%；感病品种IR24健康期利用强度较大的碳源类型为糖类(18.089%)、酯类(19.550%)和醇类(18.731%)，发病期利用强度较大的为糖类和胺类，分别为23.808%和17.195%。

从品种来看，不同品种的健康期和发病期的3个小区土壤微生物利用碳源效率分别聚为一类；感病品种IR24 健康期和发病期聚为一类，抗病品种CG2健康期和发病期对土壤微生物利用碳源效率则相差较远，并未聚为一类(图3)。

水稻健康期和发病期土壤根际微生物对 Biolog ECO 板中六类碳源的利用均有差异(如图4)，水稻健康期比发病期有了明显的提高，差异较大的主要是氨基酸类和醇类，其次是酯类。抗病水稻品种CG2健康期与发病期相比对六类碳源物质的利用明显减少：糖类减少48.51%(P<0.01)，氨基酸类减少65.55%(P<0.01)，酯类减少48.69%(P<0.05)，醇类减少66.89%(P<0.05)，胺类减少44.31%(P<0.05)和酸类减少57.39%(P<0.01)；感病水稻品种IR24健康期与发病期相比对氨基酸类、脂类、醇类、胺类和酸类五类碳源物质的利用减少：氨基酸减少24.48%(P<0.05)，酯类减少34.27%(P<0.05)，醇类减少34.78%(P<0.05)，胺类和酸类分别减少10.13%和10.38%，糖类碳源增加7.40%。

抗感两个品种对六类碳源物质的利用也存在差异；健康期抗病品种CG2对氨基酸类、胺类和羧酸类的碳源利用显著高于感病品种IR24，氨基酸类、胺类和羧酸类高分别25.92%(P<0.05)、25.99%(P<0.05)和32.15%(P<0.05)。发病期抗病品种CG2对糖类、氨基酸类、醇类碳源的利用显著低于感病品种，分别降低83.23%(P<0.01)、62.41%(P<0.05) 和 76.85%(P<0.01)。上述结果表明，抗病品种CG2在水稻细菌性条斑病发生后，氨基酸类碳源改变较为明显。

图4 根际微生物对六类碳源的利用强度

2.5 根际土壤微生物对碳源利用的主成分分析

以培养96 h的AWCD值为依据进行主成分分析，结果如图5所示。抗病品种CG2中(图5A)，第1主成分(PC1)的贡献率为94.253%，第2主成分(PC2)的贡献率为2.821%，两主成分合计贡献率为97.074%；感病品种IR24中(图5B)，第1主成分(PC1)的贡献率为99.977%，第2主成分(PC2)的贡献率为0.022%，两主成分合计贡献率为99.999%。从两个品种的主成分分析结果看，前两个主成分的贡献较高，能够表征原来 31 个变量的特征。不论是抗病品种还是感病品种，拔节期和成熟期在PC1轴上游较好地分离，抗病品种CG2和感病品种IR24的健康期主要位于第1、4象限，发病期位于第2、3象限，两个品种的主成分分析说明，健康期到发病期，水稻的根际土壤微生物群结构发生了改变。

图5 条斑病发生前后抗性差异水稻品种根际土壤微生物碳源利用主成分分析

根据Choi等[17]对碳源的选择标准,进一步利用 PC1 和 PC2 得分系数与 31 种碳源吸光度值进行相关分析得到相关系数(即主成分载荷值)，载荷绝对值大于0.18的碳源对主成分影响较大。从表4可知，抗病品种CG2中，对主成分1影响较大的碳源有10种，3种为氨基酸类：L-苯基丙氨酸(C4)、L-苏氨酸(E4)和葡萄糖-L-谷氨酸(F4)；1种胺类：腐胺(H4)；4种酸类：2-羟基苯甲酸(C3)、γ-羟基丁酸(E3)、衣康酸(F3)和 D-苹果酸(H3)；2种糖类：α-环式糊精(E1)和葡萄糖-1-磷酸盐(G2)。所有类型的碳源均为正相关。对主成分2影响较大的有8种，1种氨基酸类：L-苯基丙氨酸(C4)呈正相关；2种胺类：苯基乙胺(G4)和腐胺(H4)呈正相关；4种酸类：D,L-α-甘油磷酸盐(H2)、2-羟基苯甲酸(C3)、γ-羟基丁酸(E3)呈负相关和衣康酸(F3)呈正相关。感病品种IR24中，对主成分1影响较大的碳源有8种，2种氨基酸：L-天冬酰胺酸(B4)和L-苏氨酸(E4)；1种醇类：D-甘露醇(D2)；1种酸类：D-苹果酸(H3)；4种糖类：肝糖(F1)、α-D-乳糖(H1)、β-甲基-D-葡萄糖苷(A2)和D-木糖(B2)均呈正相关。对主成分2影响较大的碳源有13种，2种氨基酸类：L-苯基丙氨酸(C4)和L-苏氨酸(E4)；2种胺类：N-乙酰基-D-葡萄糖胺(E2)和苯基乙胺(G4)；1种醇类：i-赤藓糖醇(C2)；4种酸类：D-葡萄糖胺酸(F2)、D-半乳糖醛酸(B3)和2-羟基苯甲酸(C3)；2种糖类：α-环式糊精(E1)和葡萄糖-1-磷酸盐(G2)；2种酯类：吐温-80(D1)和D-半乳糖酸-γ-内酯(A3)均呈正相关。两个材料的结果表明水稻条斑病发生前后根际土壤微生物对氨基酸类、糖类和酸类碳源利用的差异较大。

表4 条斑病发生前后抗性差异水稻品种根际土壤微生物对31种碳源利用在 PC1、 PC2上的载荷(Loading>0.18和 Loading<0.18)

注：“-”为对主成分的贡献值的绝对值小于0.18，该碳源对主成分无影响

3 讨 论

3.1 水稻条斑病发生后根际土壤微生物多样性降低

植物对微生物的调节可能与生长状态、生育期和植物品种所分泌的有机物相关[18]，根际土壤微生物群落碳代谢多样性可以反映根际微生物的生态特征，土壤微生物群落AWCD 反映了土壤微生物利用碳源的能力和代谢活性的大小, 其值越高, 土壤微生物群落代谢活性越高[19-20]。林文雄[21]基于基因组总 DNA 的T-RFLP 分析旱直播模式下5叶期和7叶期化感水稻根际土壤微生物的组成和结构具有差异性，表明水稻根际微生物受水稻品种和生理期的影响。潘丽媛等[22]对高产示范田和常规水稻田的同一水稻品种的微生物数量进行比较，高产示范田水稻根际微生物数量是常规水稻田的2倍多，说明水稻根际微生物越丰富，水稻越高产，由此证明细菌的群落结构对水稻高产起着重要作用。杨俊等[23]研究表明不同抗性的水稻品种在条斑病发生期的水稻根际微生物多样性，抗性品种CG2高于感病品种IR24。Irikiin等[24]研究表明，碳源利用能力影响土传病害发生的可能原因是能够利用多种碳源且利用效率较高的根际微生物比碳源利用种类少的根际微生物生长更好， 微生物在根际生长旺盛，需要消耗根际大量的能源和碳源， 对病原微生物来说可用的碳源较少而不能大量增殖。本研究运用 Biolog技术对抗、感两个品种(CG2和IR24)条斑病发生前后水稻根际土壤微生物代谢功能多样性进行了分析, 研究发现无论是AWCD、微生物多样性指数, 还是对31种碳源的利用率，健康期的根际土壤微生物都显著高于发病期的根际土壤微生物。由此证明水稻根际土壤的微生物活性发生条斑病前明显高于条斑病发生后。

3.2 水稻条斑病发生后对根际土壤微生物不同碳源利用的影响

本研究发现, 水稻发生条斑病后对不同碳源的利用率下降, 且对不同碳源的利用率也不尽相同,如抗病水稻品种CG2发病期与健康期相比对六类碳源物质的利用明显减少：糖类减少48.51%(P<0.01)，氨基酸类减少65.55%(P<0.01)，酯类减少48.69%(P<0.05)，醇类减少66.89%(P< 0.05)，胺类减少44.31%(P<0.05)，酸类减少57.39%(P<0.01)；感病水稻品种IR24发病期与健康期相比对氨基酸类、脂类、醇类、胺类和酸类五类碳源物质的利用减少：氨基酸减少24.48%(P<0.05)，酯类减少34.27%(P<0.05)，醇类减少34.78%(P<0.05)， 胺类和酸类分别减少10.13%和10.38%， 糖类碳源增加7.40%。这表明水稻发生条斑病后，根际土壤微生物对氨基酸、酯类和醇类碳源的利用明显下降。同时,两个品种根际土壤对不同碳源物质利用率的下降存在一定的差异, 原因可能是CG2和IR24两个水稻品种产生的分泌物不同所导致。

微生物碳代谢多样性的主成分分析表明, 水稻条斑病发生后，由于微生物对碳源的利用有所差异,使得水稻根际微生物群落功能的多样性发生了明显改变。 抗病品种CG2利用率较高的碳源主要有 3种氨基酸类、1种胺类、4种酸类和2种糖类；感病品种IR24利用率比较高的碳源是2种氨基酸类、1种醇类、1种酸类和4种糖类。水稻在水稻条斑病发生后，由于病原菌成为植物内生菌群中的优势菌群，引起了植物根际分泌物的改变，导致根际土壤微生物多样性的降低，糖类、氨基酸类、羧酸类和胺类是区分条斑病发病前后水稻根际微生物群落功能多样性差异的敏感碳源；条斑病发病期，抗病品种根系微生物对氨基酸类和羧酸类碳源有较高的利用率，说明根系分泌中的氨基酸类和羧酸类碳源对病原菌有抑制作用或者对有益菌的生长有促进作用。

通过Biolog-ECO对不同条斑病病理期的水稻根际土壤微生物碳代谢多样性的分析，表明条斑病发生后水稻根际微生物的碳代谢多样性降低，预示水稻细菌性条斑病的侵染导致水稻根系分泌物的变化影响着根际微生物群落和病原微生物的生长及营养竞争，最终影响病害的发生与发展，而有关水稻品种之间根际分泌物及根际分微生物与条斑病菌的相互作用有待深入研究。