益母草注射液对缺血再灌注大鼠离体子宫能量代谢及子宫活动力的影响

蔡红霞，丁 妍，邢 宇

0 引言

缺血再灌注损伤的发生与多因素、多机制参与并相互作用有关，目前对其研究多集中在心、脑等重要器官。任何器官在缺血再灌注后均可能发生不同程度的损伤，子宫在卵巢肿瘤、子宫肿瘤、引产、正常分娩及产后等的治疗过程中也可能发生生殖系统缺血再灌注损伤，其中又以剖宫产、胎盘早期剥离、流产、引产、子宫破裂等手术引起的缺血再灌注损伤更加严重[1-2]，是目前女性生命及生殖安全中不容忽视的问题，但目前针对子宫缺血再灌注损伤的机制和药物研究较少，故研究子宫缺血再灌注损伤机制、寻找或筛选已知药物对子宫缺血再灌注损伤的治疗作用，对预防产后损伤具有一定的临床意义。益母草又名茺蔚、坤草、九重楼、云母草等，其新鲜或干燥地上茎或叶中富含益母草素、二萜类、黄酮类、脂肪酸类生物碱类[3-4]。其主要药理活性成分为益母草素，具有促进产后子宫复原、收缩子宫、免疫调节、抗炎、抗凝等作用，临床常利用其利尿消肿、清热凉血、活血调经之功效来治疗经闭、痛经、月经不调、产后止血、恶露不尽等妇科疾病[5-6]。本研究在建立大鼠子宫缺血再灌注损伤模型的基础上，以益母草灌流缺血再灌注损伤子宫平滑肌，观察其对子宫平滑肌能量代谢及子宫活动力的影响，为预防和治疗产后子宫损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性健康SD大鼠共40只，SPF级，体重160～170 g，购自湖北医药学院动物中心并在该中心标准实验室进行相关实验，实验室设施合格证：SYXK(鄂)2018-001，实验动物质量合格证：SCXK(鄂)2018-001。遵偱3R原则，实验过程中充分保证动物福利、给予动物人道关怀。大鼠自由饮水并饲以颗粒饲料，动物房12 h交替光照，相对湿度保持在75%左右，怛温22～24 ℃。

1.2 主要药品与设备 益母草注射液购自成都第一制药有限公司(批号：Z51021448)；肝素钠注射液购自天津生物化学制药有限公司(批号：H12020505)；戊巴比妥钠购自北京化学试剂公司(批号：060222)；LC-10T高效液相色谱仪和721型分光光度计购自赛智科技杭州有限公司；FT-1000生物张力传感器和BL420F生物电信号采集系统由成都泰盟科技有限公司提供；总腺嘌呤核苷酸(Total adenine nucleotides,TAN)、磷酸腺苷(Adenosine monophosphate,AMP)、二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP)和三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)考马斯亮蓝试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(批号：s18047，s18044，s18049)；线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性测试盒由北京索莱宝科技有限公司提供(批号：BC0515)。

1.3 模型构建与分组 手术前适应性饲养1周，挑选30只体重相近的大鼠，随机均分为模型组、缩宫素组和益母草组。三组动物均于术前1 d按2 U/鼠的剂量腹腔注射雌二醇，然后禁食6 h但不禁水。用3%戊巴比妥钠(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉，腹部向上固定，下腹部至耻骨联合处剃毛后消毒，纵形切开皮肤，然后再切开腹白线，暴露大鼠膀胱及子宫，用棉签小心向上推离膀胱，分开肠管，可见到粉红色子宫。从大隐静脉注射0.1 ml肝素钠注射液(500 U)，5 min后游离出大鼠腹腔动脉，向下分离出髂总动脉，注意避免损伤髂腰动、静脉致动物大出血。然后在腹腔动脉与髂总动脉分叉处上方0.5 cm处，用4-0号手术线结扎腹腔动脉，阻断子宫血供，30 min后剪断结扎线，再灌注45 min即可成模[7]。另取10只于实验前1 d按2 U/鼠的剂量腹腔注射雌二醇，但不手术建模的大鼠，设为假手术组。

1.4 离体子宫平滑肌取样方法 于再灌注45 min后，分离出V形子宫并游离两侧子宫角，用眼科剪从阴道与子宫汇合处剪断，可得到2条子宫，将离体子宫置于装有4 ℃、通有95% O2和5% CO2泡合乐氏液的培养皿中备用。

1.5 离体子宫平滑肌灌流记录子宫活动力 取上述备用的右侧子宫，分离掉子宫圆韧带和子宫附着的脂肪，将子宫剪成子宫平滑肌条(长约3 cm)。用4-0号丝线结扎，然后将子宫平滑肌条一端固定在水浴锅通气钩上，另一端连接FT-1000生物张力传感器，将子宫平滑肌条置于pH 7.3～7.5的乐氏液(10 ml)的恒温浴槽内，浴槽温度恒定于(30±1)℃，通95% O2和5% CO2的混合气体，将通气量调整为2个气泡/s。然后给标本加1 g前负荷，以保证子宫平滑肌处于比较稳定的活动状态，平衡30 min，其间每10 min换乐氏液1次，共3次，然后开始用相应的药物灌流并用BL420F生物电信号采集系统记录离体子宫平滑肌收缩频率、收缩张力，计算离体子宫活动力。其中模型组和假手术组在浴槽中加入0.1 ml生理盐水对照，缩宫素组在浴槽中加入0.1 ml缩宫素注射液，益母草组在浴槽中加入0.1 ml益母草注射液，分别记录离体子宫平滑肌的收缩频率和收缩张力，并据此计算离体子宫活动力。离体收缩张力：以每次子宫平滑肌收缩所达到的最高点来表示(g)。离体收缩频率：以每分钟子宫平滑肌收缩的次数表示(次/min)。离体子宫活动力=收缩张力×收缩频率。

1.6 高能磷酸化合物(Energy rich phosphate compounds,EPC)水平和Ca2+浓度检测 在离体子宫平滑肌灌流实验结束后，取子宫平滑肌标本，剪成3段，取其中一段用滤纸吸干，用4 ℃的HEPES冲洗液冲洗后制成组织匀浆，高速离心机离心力调到3 000 r/min，离心15 min后取上清分装备检。采用考马斯亮蓝染色试剂盒检测子宫组织EPC中AMP、ADP和ATP含量；然后计算TAN总量(TAN=ATP+ADP+AMP)。取其中一段组织，采用原子吸收光谱法检测子宫平滑肌组织中Ca2+浓度。

1.7 线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ～Ⅳ活性 用线粒体呼吸链复合体活性测试盒检测离体子宫平滑肌标本线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ～Ⅳ含量，操作步骤：取其中一段子宫组织，准确称取10 mg，按试剂盒说明书操作步骤进行检测：加入1 ml试剂1和10 μl试剂3，用研钵研磨后匀浆。4 ℃下匀浆3 000 r/min离心5 min。弃去沉淀组织，取上清液50 μl移至另一离心管中，4 ℃下以6 000 r/min离心力离心10 min。取上清液加入2 μl试剂3和200 μl试剂2，然后超声波破碎后编号待测。分光光度法：分光光度计预热30 min，波长调至340 nm，用蒸馏水调零。将上述待测样本37 ℃孵育5 min。将孵育后备测样本取40 μl加入石英比色皿中比色，记录340 nm处初始吸光值A1和2 min后的吸光值A2，计算公式：ΔA(待测样本吸光度值)=A1-A2。

2 结果

2.1 不同灌流方法对缺血再灌注后离体子宫平滑肌活动力和Ca2+浓度的影响 假手术组可记录到离体子宫平滑肌的正常生理活动(如收缩张力、收缩频率)。与假手术组比较，模型组缺血再灌注后离体子宫平滑肌活动力降低，标本收缩张力、收缩频率和子宫活动力、Ca2+浓度均低于假手术组(P<0.05)。缩宫素组和益母草组分别灌流缩宫素注射液和益母草注射液后，收缩张力、收缩频率和子宫活动力均明显升高，但没有恢复到假手术组水平(P<0.05)，与模型组和假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)；Ca2+浓度明显升高，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。缩宫素组和益母草组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 不同灌流方法对缺血再灌注离体子宫平滑肌EPC水平的影响 与假手术组比较，模型组ADP、AMP、ATP、TAN均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。缩宫素组ADP、AMP、ATP、TAN有一定程度升高，与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)。益母草组ADP、AMP、ATP、TAN明显升高，与模型组和缩宫素组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 益母草对缺血再灌注离体子宫平滑肌线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ～Ⅳ的影响 与假手术组比较，模型组离体子宫平滑肌线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ～Ⅳ均明显降低，与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)。缩宫素组离体子宫平滑肌线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ～Ⅳ有一定程度升高，但Ⅰ～Ⅳ活性未升高到对照组水平，与对照组和模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。益母草组离体子宫平滑肌线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ～Ⅳ明显升高，与模型组和缩宫素组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表1 四组缺血再灌注后离体子宫平滑肌活动力比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表2 四组缺血再灌注后离体子宫平滑肌EPC水平比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与缩宫素组比较，△P<0.05

表3 四组缺血再灌注后离体子宫平滑肌线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ～Ⅳ含量比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与缩宫素组比较，△P<0.05

3 讨论

益母草具有利水消肿、活血调经之功效，常用于治疗产后腹痛、月经不调、水肿及尿不利等。益母草注射液是从益母草全草中提取的单方制剂，对子宫有较强的兴奋作用，临床常与缩宫素联合使用，用于预防或治疗流产及产后子宫出血[8-9]。

子宫有创检查、子宫破裂、流产引产、胎盘早期剥离、子宫外伤、剖宫产等均可能伴发子宫术后缺血再灌注损伤[10-11]。缺血再灌注损伤是一个多因素参与、多机制共同作用的复杂病理生理学过程，自由基产生、细胞凋亡、免疫状态异常、钙超载等均是引起组织器官缺血再灌注损伤的始动因素[12-13]。除上述氧化应激反应作用外，子宫缺血再灌注损伤还与能量代谢异常有一定的关系。尽管子宫术后缺血再灌注损伤对子宫造成的严重危害会影响到子宫的生殖功能，但目前临床上还未引起足够重视。

细胞呼吸链是机体能量代谢过程的重要环节，主要由4种酶复合体即复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组成，是线粒体这一连续反应体系最基本的功能。细胞呼吸链由一系列的递电子反应和递氢反应按一定的顺序发生反应后生成水和ATP，其本质是辅酶、酶、辅因子或辅基参与机体的代谢功能，当不同外因引起线粒体呼吸链酶被阻断或抑制后，如组织缺血缺氧、线粒体呼吸链酶复合物缺陷及呼吸链抑制剂等均可阻断或抑制呼吸链递电子反应和递氢反应中的电子传递，引起机体迅速死亡。ATP由线粒体生成，其内膜/外膜及基质上酶复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的含量及活性在细胞能量代谢的过程中起着极其重要的作用，线粒体功能障碍在子宫术后缺血再灌注损伤能量代谢失衡中起重要作用[14-15]。因此，检测子宫平滑肌线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ～Ⅳ的活性可以确定子宫缺血再灌注损伤时子宫平滑肌的能量代谢状况。本研究显示，益母草组离体子宫平滑肌线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ～Ⅳ明显升高，提示益母草注射液作用于子宫平滑肌细胞呼吸链，维持线粒体的正常递电子反应和递氢反应，以生成子宫平滑肌细胞正常生理功能所必需的ATP。

在能量代谢过程中，细胞必须不断合成ATP以维持能量代谢的正常进行，EPC中的ATP、AMP和ADP均为机体细胞代谢提供能量。机体能量代谢分为有氧代谢和无氧代谢2种途径。在有氧代谢途径中，ATP水解成AMP、ADP的同时释放出自由能，参与糖、脂肪、蛋白质、核酸及核苷酸等的代谢。但在缺血或缺血再灌注后，组织器官均有不同程度的缺血或缺氧，此时有氧代谢途径受阻，ATP、AMP、ADP合成降低，不能为细胞提供正常活动的能量，无氧代谢途径被激活，ATP将依次降解ADP、AMP、腺苷、次黄嘌呤，并最终在体内生成乳酸，释放出的化学能为肌肉收缩提供能量。但无氧代谢途径效率较低，生成的ATP、AMP、ADP减少，故TAN合成也降低，细胞因能量供给不足而出现代谢紊乱、并最终造成结构破坏及功能异常[16-17]。因此，改善和保证EPC的正常代谢是纠正缺血再灌注损伤引起的能量代谢障碍、维持组织器官正常功能的前提。本实验观察到益母草组离体子宫平滑肌中ATP、AMP、ADP和TAN均较模型组明显提高，提示益母草可促进组织能量代谢、增强组织供能，从而改善和纠正子宫缺血再灌注损伤引起的能量代谢障碍。

有研究表明，益母草可增强子宫收缩力[18-19]。肌肉收缩与Ca2+通道开放及Ca2+内流有关，Ca2+内流可增强肌肉收缩力。为进一步研究改善和纠正子宫缺血再灌注损伤后能量代谢障碍与子宫活动力的关系，本研究还观察了不同灌流方法对缺血再灌注后离体子宫平滑肌活动力和Ca2+浓度的影响，发现益母草组离体子宫平滑肌收缩张力、收缩频率和子宫活动力均明显升高，但没有恢复到假手术组水平，Ca2+浓度则明显升高。提示益母草注射液可促使Ca2+通道开放并促进Ca2+内流，而Ca2+内流可增强肌肉收缩力。这进一步证实益母草注射液可能通过开放Ca2+通道而增强离体子宫平滑肌对益母草注射液的敏感性，并通过促进能量代谢而发挥对缺血再灌注子宫的保护作用。