参麻益智方对双侧颈动脉结扎大鼠海马认知功能的影响

曹 宇，刁雪梅2，李泽惠，李 琨3，刘美霞，裴 卉，李 浩

血管性痴呆(vascular dementia，VaD)是指由脑血管病变引起的或与脑血管病变有关的一种获得性慢性进行性智力损害综合征，临床表现为智能障碍，包括认知能力、记忆力、判断和思维能力、计算能力和社会生活能力的减退[1-2]。VaD是仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的第二大导致痴呆的疾病[3]，给社会带来巨大经济负担。VaD发病机制尚不明确，目前关于VaD发病机制的假说包括脑能量代谢障碍、氧化应激损伤、炎性反应、胆碱能系统失衡等[4-5]。海马星形胶质细胞和小胶质细胞增殖、激活引起炎性反应是VaD的重要病理特征[6-7]。参麻益智方是临床治疗VaD的常用方，取得较好疗效，该方由人参、天麻、鬼箭羽、川芎组成，具有补虚增智、活血平肝之功效。临床研究表明，参麻益智方能改善VaD病人的认知功能障碍[8-9]。本研究旨在探讨参麻益智方对双侧颈动脉结扎大鼠海马CA1区星形胶质细胞及小胶质细胞活化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验药物 参麻益智方由人参、天麻、鬼箭羽、川芎组成(3∶3∶3∶2)，均购自中国中医科学院西苑医院。按照人与大鼠用药剂量换算方法取各药共5 200 g，纯净水浸泡30 min，入砂锅文火煎煮30 min，倒出药汁，加纯净水两次煎煮20 min。合并两次药汁，过滤后置于100 ℃恒温水浴箱浓缩至100%，即含生药1 g，4 ℃避光保存。

1.2 实验动物及分组 选用雄性SPF级10周龄Wistar大鼠80只，体重(300±20)g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0002。大鼠饲养于人工光照明暗各12 h饲养室内，温度(23±2)℃，湿度(50±10)%，标准饲料和自来水自行取用。经1周适应性喂养后进行实验。中药低剂量参麻益智方组(SMYZ-L)、中剂量组(SMYZ-M)、高剂量组(SMYZ-H)，每组10只，分别予3.3 mg/kg、6.6 mg/kg、16.5 mg/kg灌胃；盐酸多奈哌齐组(Donepezil组，10只)给予0.5 mg/kg药物灌胃，假手术组(Sham组，10只)及双侧颈动脉结扎组(2-VO组，10只)给予等量蒸馏水灌胃。各组大鼠连续灌胃4周，大鼠喂养严格遵照动物保护协会相关规定。本研究获得中国中医科学院西苑医院伦理委员会批准，批准编号2018XLC008-1。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠一般情况 给药结束后，观察大鼠精神状态、毛色、活动度及体质量。

1.3.2 大鼠2-VO模型 大鼠术前禁食，行无菌手术操作。以2%戊巴比妥钠(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，仰卧固定，刮除颈部被毛，碘消毒颈部，纵行剪开颈部皮肤1.5～2.0 cm，钝性分离皮下组织及肌肉，暴露双侧颈总动脉，使用手术线于双侧颈总动脉近心端和远心端分别结扎，之后将两结扎处之间剪断。缝合皮肤，保温回笼饲养。模型组及药物治疗组结扎双侧颈总动脉，假手术组仅分离双侧颈总动脉。术后肌肉注射青霉素预防感染。手术时室温控制在28 ℃，术后24 h内控制在25 ℃时大鼠状态稳定。各组大鼠清醒后参照Longa等[10]5级评分法进行神经功能评分：0分，无神经功能缺损体征；1分，对侧前肢屈曲、不能伸直、同侧霍纳征，表现为提颈时左上肢向下、不能上抬；2分，向外侧转圈(大部分向左，小部分向右)；3分，行走时向对侧倾倒；4分，不能自发行走、意识丧失。评分1～3分视为大鼠造模成功，造模失败大鼠剔除并在后续实验不足保证每组10只。

1.3.3 Morris水迷宫评价空间记忆能力 给药结束后次日进行Morris水迷宫实验(ZS-001型Morris水迷宫系统，北京众实迪创科技发展有限责任公司)。前5 d为定位航行实验：将大鼠头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北4个起始位置之一。记录动物找到水下平台时间(s)，若探索时间超过90 s，引导动物到平台并让其在平台上停留10 s。将动物移开、擦干。每只动物每日训练4次，两次训练间隔15～20 min。最后一次定位航行实验结束后次日将平台撤除，开始90 s探查训练。入水点为原先平台象限的对侧，记录大鼠在原先放置平台象限花费时间，以此作为空间记忆的检测指标。

1.3.4 免疫组化检测小胶质细胞和星形胶质细胞 Morris水迷宫实验后，以2%戊巴比妥钠(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，大鼠经主动脉灌流后固定，断头取脑。各组取5只进行全脑固定、石蜡包埋、切片，冠状位切片，厚度10 μm。分别滴加抗GFAP(protein tech公司，1∶300)和抗Iba-1抗体(proteintech公司，1∶300)行免疫组织化学染色。每张切片于100倍光镜下观察其形态数量，并进行拍照。

2 结 果

2.1 实验动物一般情况 与Sham组比较，2-VO组大鼠精神状态明显萎靡不振，毛色无光泽而枯槁竖毛，活动度及体质量明显下降。给药后，各组大鼠状态较2-VO组有明显改善；其中灌胃参麻益智方后大鼠精神状态较好，体质量恢复，Sham组轻，毛发略散乱有光泽，未见毛色枯槁或散乱竖毛，活动增多。

2.2 参麻益智方对双侧颈动脉结扎大鼠行为学的影响 与Sham组比较，2-VO组大鼠在水迷宫实验到达安全平台游泳时间(逃避潜伏期，escape latency)明显延长(P<0.05)，提示双侧颈动脉结扎能明显降低大鼠空间记忆能力。经过参麻益智方中剂量(6.6 mg/kg)、高剂量(16.5 mg/kg)及多奈哌齐(0.5 mg/kg)干预后，从第3天开始逃避潜伏期均较2-VO组显著降低(P<0.05)。撤去安全平台后，SMYZ-M组、SMYZ-H组及Donepezil组大鼠目标象限停留时间百分比明显提高(P<0.05)，说明参麻益智方和多奈哌齐可恢复大鼠记忆能力。详见图1。

与2-VO组比较，*P<0.05

2.3 参麻益智方对星形胶质细胞的影响 100倍显微镜下观察海马CA1区星形胶质细胞形态，2-VO组星形胶质细胞增生，表现为细胞数量增多，胞体变大，突起增多、变长并交织成网状；给药后，Donepezil组与SMYZ-H组、SMYZ-M组GFAP阳性细胞数量较2-VO组减少，突起变短、变细，胞体变小。详见图2。

图2 大鼠海马CA1区星形胶质细胞(×100)

2.4 参麻益智方对小胶质细胞的影响 100倍显微镜下观察海马CA1区小胶质细胞形态，相较于Sham组，2-VO组小胶质细胞胞体变大，由分支状变为突起少而短的灌木样细胞，甚至进一步转化为“阿米巴样”圆形细胞。Donepezil组与SMYZ-H组、SMYZ-M组均有散在的小胶质细胞激活，较2-VO组数量减少。详见图3。

图3 大鼠海马CA1区小胶质细胞(×100)

3 讨 论

星形胶质细胞是中枢神经系统(central nervous system，CNS)中的丰富细胞，为神经元提供营养支持，促进突触形成和功能，通过吞噬作用修剪突触，并实现一系列其他稳态维持功能。星形胶质细胞在脑损伤和疾病后发生显著转化，称作“反应性星形细胞增生(reactive astrocytosis)”，相关研究表明，反应性星形胶质细胞阻碍CNS恢复[11-12]。

小胶质细胞是CNS中固有的免疫细胞，是促炎细胞因子的主要来源，能调节大脑发育，维持神经元网络和损伤修复[13]。正常情况下小胶质细胞处于相对静息状态，表现为胞体较小，突起细且长满分支；CNS损伤或衰老过程，小胶质细胞激活，突起回缩变短，胞体变大，呈现阿米巴样形态[14]。过度激活的小胶质细胞分泌促炎性因子，产生自由基，引起神经元继发性损伤，从而抑制小胶质细胞激活，缓解神经炎症反应，进而减轻CNS损伤[15-17]。

VaD是导致痴呆疾病的第二种常见类型，仅次于AD，因其具有可防治性，也称作“可逆性痴呆”，药物及非药物疗法在改善VaD病人症状和减轻家庭照料负担方面起到积极作用，目前尚缺乏根本有效的早期诊断与防治措施[18-19]。随着中医药对VaD研究深入，中药因其多靶点、多途径作用机制在改善VaD方面有突出优势。中医认为痴呆发生与年老体衰、气虚血瘀有关。如《千金翼方》曰：“人年五十以上，阳气日衰，损与日至，心力渐退，忘前失后，兴居怠惰，计授皆不称心。”《内经》曰“蓄血在上，善忘”；王清任亦曰：“瘀血也令人善忘”。卒中后认知障碍(post-stroke cognitive impairment，PSCI)是临床VaD的常见亚型[20]。古籍中亦有相关记载，清朝叶天士《临证指南医案》中记载有：“中风初起，神呆遗尿，老人厥中显然”；《杂病源流犀烛·中风》有“中风后善忘”之论。由此可见肝阳上亢，化火生风，风阳上扰清窍，可发为痴呆。参麻益智方针对VaD气虚血瘀、肝风内动病理特点而设，由人参、天麻、鬼箭羽、川芎组成，具有补虚增智、活血平肝之功。方中以人参为君，具有大补元气、安神增智之效；天麻为臣，具有平肝息风，滋阴潜阳，君臣相合，共奏活血通经之效；鬼箭羽为佐，以行血通络散瘀，可助推陈致新，恢复水精平衡，并以川芎为使，兼引经药，载诸药直入血分达脑窍。诸药合用，共奏补虚益智，平肝潜阳，化瘀通络之功。本研究结果显示，高剂量及中剂量参麻益智方干预2-VO大鼠，4周后可缩短大鼠逃避潜伏期，提高大鼠停留在目标象限时间，说明参麻益智方能提高VaD模型大鼠的空间记忆能力。进一步研究显示参麻益智方能抑制海马CA1区小胶质细胞和星形胶质细胞的激活和增生，这可能是参麻益智方提高慢性低灌注大鼠认知功能的机制之一。