不同采收期铁皮石斛主要成分含量测定及比较

浙江省中药研究所有限公司，浙江 杭州 310013

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)为石斛之极品，因其表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛具有独特的药用价值，被誉为“九大仙草”之首，《神农本草经》曰“主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸瘦、强阴、久服厚肠胃”，现代研究表明铁皮石斛的茎能够益胃生津，滋阴清热，对治疗口干烦躁、食少干呕、阴虚火旺有很好的疗效。文献报道[1]对铁皮石斛药材的质量标准及最佳采收期进行研究，但其以总水溶性糖及总水溶性多糖含量为分析指标，发现11～3月期间含量较高，开花期4～5月明显下降，随后又开始回升，并且未参照最新版《中国药典》进一步对头年11月份到次年3月份的差异开展研究，故本实验在2015版《中华人民共和国药典》指导下，测定了浙江某种植基地头年11月份到次年3月份不同采收时间两年生铁皮石斛中的多糖含量、甘露糖含量、甘露糖与葡萄糖峰面积比及乙醇浸出物含量，从而为铁皮石斛最佳采收期和药材质量控制提供了一定的参考依据。

1 仪器与材料

1.1 药品与试剂 铁皮石斛样品采自浙江某种植基地，取自生长期为两年的铁皮石斛的干燥茎，经过浙江省中药研究所教授级高工王志安鉴定为铁皮石斛药材，样品干燥粉碎过三号筛。采收期分别为：浙1号到浙6号(2014年10月)，浙7号到浙12号(2014年12月)，浙13号到浙18号(2015年3月)，浙19号到浙24号(2015年5月)，浙25号到浙30号(2015年7月)。D-无水葡萄糖标准品(批号：110833-201205，中国食品药品检研究院，含量99.5%)。5%苯酚溶液：称取苯酚(分析纯，批号：20141108，兰溪市六洞山化工试剂厂)2.5 g，加纯水50 mL，摇匀即得(临用配制)。硫酸(分析纯，批号：20141108，杭州双林化工试剂厂)，95%乙醇(批号：20150104，杭州化学试剂有限公司)。

1.2 仪器 Lambda 20紫外/可见分光光度计(美国PERKIN ELMER公司)，METTLER TOLEDOAB204-S电子天平(瑞士METTLER公司)，TC-15套式恒温锅(浙江海宁新华医疗器械厂)，Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent 20RBAX SB-C18色谱柱。

2 方法

2.1 多糖含量测定

2.1.1 供试品溶液的制备 取本品粉末约0.3 g，加水200 mL，加热回流2 h，放冷，转移至250 mL量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置15 mL离心管中，精密加入无水乙醇10 mL，摇匀，冷藏1 h，取出，离心(转速为每分钟4000转)30 min，弃去上清液(必要时滤过)，沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次8 mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至25 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 标准曲线制备 精密量取对照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分别置10 mL具塞试管中，各加水补至1.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL(临用配制)，摇匀，再精密加硫酸5 mL，摇匀，置沸水浴中加热20 min，取出，置冰浴中冷却5 min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在488 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.1.3 测定法 精密量取供试品溶液1 mL，置10 mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1 mL起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的量，计算，即得[1]。

2.2 甘露糖含量测定

2.2.1 甘露糖色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液(20∶80)为流动相；检测波长为250 nm。理论板数按甘露糖峰计算应不低于4000。

2.2.2 校正因子测定 取盐酸氨基葡萄糖适量，精密称定，加水制成每1 mL含12 mg的溶液，作为内标溶液。另取甘露糖对照品约10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，精密加入内标溶液1 mL，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取400 μL，加0.5 mol/L的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液与0.3 mol/L氢氧化钠溶液各400 μL，混匀，70 ℃水浴反应100 min。再加0.3 mol/L的盐酸溶液500 μL，混匀，用三氯甲烷洗涤3次，每次2 mL，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液10 μL，注入液相色谱仪，测定，计算校正因子。

2.2.3 测定法 取本品粉末(过三号筛)约0.12 g，精密称定，置索氏提取器中，加80%乙醇适量，加热回流提取4 h，弃去乙醇液，药渣挥干乙醇，滤纸筒拆开置于烧杯中，加水100 mL，再精密加入内标溶液2 mL，煎煮1 h并时时搅拌，放冷，加水补至约100 mL，混匀，离心，吸取上清液1 mL，置顶空瓶中，加3.0 mol/L的盐酸溶液0.5 mL，封口，混匀，110 ℃水解1 h，放冷，用3.0 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至中性，吸取400 μL，照校正因子测定法，自“加0.5 mol/L的PMP甲醇溶液”起，依法操作，取上清液10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得[1]。

2.3 甘露糖与葡萄糖峰面积比 取葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含50 μg的溶液，作为对照品溶液。精密吸取0.4 mL，按照2015版《中国药典》一部铁皮石斛项下含量测定甘露糖项下方法依法测定。

2.4 浸出物 按照2015版《中国药典》通则2201的热浸法测定，用乙醇作溶剂。2.1～2.4结果见表1和表2。

3 结果

3.1 不同采收期铁皮石斛茎的主要成分含量 见表1。

表1 不同采收期铁皮石斛茎的主要成分含量

注：多糖、甘露糖、乙醇浸出物含量按照干燥品计算。

2.2 不同采收期铁皮石斛茎主要成分含量的统计学处理结果见表2。

组别多糖含量/%甘露糖含量/%甘露糖/葡萄糖的峰面积比乙醇浸出物/%第一组(2014.10)31.6±2.832.3±3.63.2±0.712.6±1.8第二组(2014.12)29.9±1.931.4±1.73.5±0.3 12.1±1.2第三组(2015.3)38.3±2.7∗35.0±3.52.0±0.6∗6.4±1.7∗第四组(2015.5)27.5±1.930.1±1.83.7±0.411.8±1.0第五组(2015.7)29.5±1.731.7±2.13.4±0.3 10.5±0.8

注：与第一组比较，*P<0.05。

4 讨论

根据2015版《中国药典》一部[2]：供试品溶液的制备流程其中一部分为“(转速为每分钟4000转)离心20 min，弃去上清液(必要时滤过)”，此处值得商榷。因为离心后容易出现白色沉淀，有一部分粘附离心管壁上，还有少量很淡的白色沉淀在上清液里，倾倒上清液时容易损失，造成多糖含量偏低，如果改为“(转速为每分钟4000转)离心30 min，上清液滤过，用少量热水洗涤滤纸数次，合并滤液”，这样较为妥当。原因是离心时间延长，可以把白色沉淀最大限度附着在离心管壁上，过滤可以保证很淡的白色沉淀得以留在滤纸上，最大限度减少不同采收时间多糖含量的差异。

比较表1和表2中采收期(2014.10与2015.3)的铁皮石斛，多糖含量增加，乙醇浸出物含量呈现递减趋势。一般情况乙醇浸出物是指用95%的乙醇采用热浸法提取制得。高浓度的乙醇提取出的成分主要是脂溶性成分为主，而多糖易溶于热水属于水溶性成分。药材多糖含量增加，意味着脂溶性成分占比下降，所以乙醇浸出物含量呈现递减趋势。药材多糖含量增加，甘露糖与葡萄糖峰面积比呈现递减趋势可能原因是多糖含量增加，葡萄糖峰面积呈现出上升趋势，甘露糖与葡萄糖峰面积比中的分母增加，所以两者的面积比呈现下降趋势。根据实验结果，铁皮石斛头年10月到翌年3月多糖含量最高，这段时间为最佳采收期。此外铁皮石斛(2015.3采收)比铁皮石斛(2014.10采收)多糖含量高，从另一方面证实了本文结论如果中药生产过程中，以铁皮石斛多糖为主要有效成分，次年3月采收铁皮石斛比头年10月采收要更科学合理，符合石斛生长过程中多糖含量变化的规律[3-15]。铁皮石斛每年4～5月份为开花期，多糖含量明显下降后又开始回升，最佳生长期和最佳采收期基本符合。本研究可以为企业的石斛种植和采收提供了可靠的科学依据。