张琪 董海常 刘建涛 卜培龙 李全营 秦长江
大肠癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤之一,总体生存率较低[1]。据统计,中国大肠癌的发病率占所有恶性肿瘤的第4位,死亡率居第5位[2],严重威胁着人类的健康。由于大肠癌起病隐匿,通常就诊时已发展为进展期或晚期大肠癌。近年来,随着对大肠癌的认识及诊治水平的不断提高,大肠癌的发病率和死亡率较前有所减低,但最新统计数据表明大肠癌的新发病例及死亡率在全球仍居第3位[3-4]。
驱动蛋白家族成员20A(kinesin family member 20A,KIF20A)位于人5q31.2染色体上,主要通过与微管结合,水解ATP产生机械能,干扰细胞有丝分裂过程[5],在肿瘤的发生和发展中起着重要作用。多项研究表明,KIF20A 在人类多种恶性肿瘤如恶性黑色素瘤[6]、乳腺癌[7-8]、鼻咽癌[9]、胰腺癌[10-12]、肝细胞癌[13]及肺癌[14-15]等异常表达,且与肿瘤的增殖、侵袭及预后密切相关。目前尚缺乏KIF20A在大肠癌中的研究报道。
本研究首先通过分析TCGA数据库中KIF20A在大肠癌组织中的mRNA表达,然后采用免疫组织化学法进一步检测KIF20A在大肠癌组织中的蛋白表达情况,并分析其表达与临床病理参数及预后之间的相关性,探讨其在大肠癌临床诊治过程中的价值,以期作为新的生物标志物,为大肠癌的早期诊断及预后评估提供新的理论依据。
收集2011年1月至2012年12月在河南大学淮河医院105 例经术后病理学检测确诊为大肠癌的石蜡组织样本。所有样本均采用美国癌症联合委员会(AJCC)确定组织学肿瘤分级和分期。其中男性65例,女性40 例;年龄≤60 岁46 例,>60 岁59 例。纳入标准:1)术前未进行新辅助治疗,包括放疗、化疗、放化疗;2)原发肿瘤为大肠癌,无合并其他恶性肿瘤或转移肿瘤;3)临床病例资料完整。排除标准:1)复发性结直肠癌或者合并有其他脏器的原发恶性肿瘤史;2)有肺部、肝脏等远处转移的患者。
1.2.1 生物学分析 本研究从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库(https://genomecancer.ucsc.edu)下载所有可用的大肠癌mRNA 数据表达谱,包括380 例癌组织和50 例癌旁正常组织。使用Excel 2016和GraphPad 6.0软件对数据进行Log2转换和分析。
1.2.2 免疫组织化学法 石蜡包埋经甲醛固定的大肠癌组织标本,组织切片机切成4 μm厚的连续切片,二甲苯脱蜡,梯度酒精(依次100%、100%、95%、80%、70%)水化,pH 6.0的柠檬酸钠进行抗原修复,一抗孵育(1:100,购自美国Abcam 公司)4℃过夜,加入生物素化二抗,室温摇床孵育1h,使用辣根过氧化氢酶(DAB)显色剂显色,自来水冲洗,苏木精复染,返蓝,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片,光学显微镜下观察并拍照。
所有切片染色结果均由2 位病理科医师随机选取5 个高倍视野进行评分。染色强度按以下标准评分:0分:不染色;1分:弱染色(淡黄色);2分:中染色(黄棕色);3 分:强染色(棕褐色)。肿瘤细胞阳性率评分如下:0 分:无阳性肿瘤细胞;1 分:<25%的阳性肿瘤细胞;2 分:25%~50%的阳性肿瘤细胞;3 分:50%~75%的阳性肿瘤细胞;4分:≥75%的阳性肿瘤细胞。通过将阳性肿瘤细胞的百分比和染色分数的乘积作为最终染色指数(SI)。根据此方法,SI≥4的切片定义为高表达,SI<4为低表达,SI=0为阴性表达。
1.2.3 随访 随访主要通过复诊、电话、微信等方式进行,以大肠癌确诊时间为起点,肿瘤复发转移、死亡或末次随访时间为观察终止时间点,截止时间为2017年12月。
所有数据均使用SPSS 19.0 统计学软件进行分析。采用χ2检验分析KIF20A表达水平与临床病理参数及预后之间的相关性;用Kaplan-Meier检验绘制生存曲线;Log-Rank检验和Cox比例风险回归模型分别进行相关性分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
对TCGA数据库中KIF20A在大肠癌组织与癌旁正常组织中的表达水平进行分析,结果显示,KIF20A在大肠癌组织中的mRNA 表达水平显著高于癌旁正常组织,两者比较差异具有统计学意义(P<0.001,图1A)。在配对癌组织与癌旁正常组织中,KIF20A 在大肠癌组织中的mRNA 表达水平同样显著高于癌旁正常组织(P<0.001,图1B)。
图1 大肠癌与癌旁正常组织中KIF20A差异表达
大肠癌组织中KIF20A的蛋白表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、肿瘤位置无显著相关性(P>0.05)。而与肿瘤浸润深度(T分期)、淋巴结转移(N分期)、远处转移(M分期)、TNM分期有显著相关性(P<0.05,表1)。
采用免疫组织化学法分析KIF20A在大肠癌组织和配对癌旁正常组织中的蛋白表达水平。105 例患者中,64%(67/105)大肠癌组织KIF20A 显著高表达,36%(38/105)患者呈阴性或低表达(P<0.05),差异具有统计学意义。KIF20A表达主要定位于细胞质和细胞膜,呈团片状分布,染色强度深浅不一(图2A,B)。
与KIF20A低表达的患者相比,KIF20A高表达的患者总体生存时间显著缩短(P<0.001,图2C)。KIF20A高表达患者较低表达患者的无复发生存时间也明显缩短差异具有统计学意义(P<0.001,图2D)。单因素分析结果显示肿瘤大小、分化程度、T 分期、N分期、M 分期、TNM 分期、KIF20A 表达与预后均具有相关性(P<0.05);而患者性别、年龄、肿瘤位置与预后无相关性(P>0.05)。Cox 比例风险回归模型分析结果显示KIF20A表达是影响大肠癌患者预后的独立危险因素(P<0.05,表2,3)。
表1 105例大肠癌患者临床病理参数与KIF20A表达的相关性
表1 105例大肠癌患者临床病理参数与KIF20A表达的相关性(续表1)
图2 免疫组织化学法分析KIF20A在大肠癌组织与癌旁正常组织中的蛋白表达水平及其与预后的关系
表2 总体生存期的单因素和多因素Cox回归分析
表2 总体生存期的单因素和多因素Cox回归分析(续表2)
表3 无复发生存期的单因素和多因素Cox回归分析
驱动蛋白家族作为具有ATP 酶活性的微管马达蛋白,是一类在生物物种进化过程中高度保守的多基因家族,于1985年在鱿鱼的神经元轴突中首次被发现[16]。KIF20A(也称RAB6KIFL,the Rab6-binding kinesin)作为驱动蛋白家族的一员,最先发现定位于高尔基体中,并通过与GDP-bound 形式的Rab6 相互作用在细胞动力学中发挥重要功能[17]。KIF20A通过与微管结合,水解ATP产生机械能,主要干扰细胞有丝分裂过程[5]。KIF20A的异常表达主要是通过干扰细胞有丝分裂过程中纺锤体的形成和染色体的分离,从而形成多倍体,最终导致肿瘤细胞增殖、侵袭及远处转移,影响患者的预后。
近年研究表明,KIF20A在胰腺癌组织中高表达,沉默KIF20A表达可显著抑制胰腺癌的侵袭和迁移能力,提示KIF20A 可能具有某种癌基因特性[12]。本研究通过分析TCGA 数据库中KIF20A 在大肠癌中的mRNA 表达水平,发现与癌旁正常组织相比,KIF20A在大肠癌组织中表达上调,差异具有统计学意义。进一步通过免疫组织化学法检测105 例大肠癌患者组织中KIF20A的蛋白表达水平,结果表明KIF20A在大肠癌组织中高表达,在癌旁正常组织中低表达或阴性表达,提示KIF20A 可能在大肠癌的发生发展过程中扮演着癌基因的角色,促进大肠癌进展。
越来越多的证据表明,KIF20A 在恶性肿瘤进展中发挥着关键作用。有研究报道敲除KIF20A能够有效抑制胃癌细胞活性,诱导细胞有丝分裂(G2/M 期)阻滞,并增强抗癌药物的敏感性,有助于改善患者预后[18]。Yamashita 等[6]证实KIF20A 高表达的恶性黑色素瘤患者无复发生存期缩短,提示是一种新型的黑色素相关抗原,表明KIF20A 是一种有助于黑色素瘤诊断和预测预后的重要指标。有研究显示,KIF20A在乳腺癌中的过表达与盆腔淋巴结转移阳性有关,被认为是乳腺癌的独立预后指标[19]。但是其潜在的分子机制尚不清楚,KIF20A 与大肠癌的关系也尚不明确。
本研究进一步分析KIF20A表达与临床病理参数及预后之间的相关性,发现KIF20A 蛋白表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、肿瘤位置无相关性,而与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM 分期有显著相关。提示KIF20A 蛋白阳性表达的患者通常肿瘤浸润深度更深,TNM分期更晚,淋巴结转移阳性及远处转移的可能性更大,这些结果表明KIF20A表达可能与大肠癌疾病进展有关。生存分析结果显示KIF20A 高表达与患者不良预后相关,与Liu等[9]报道一致。Cox回归分析进一步表明KIF20A是影响大肠癌患者预后的独立危险因素,可能作为预测大肠癌不良预后的重要标志物。
综上所述,本研究结果提示KIF20A 在大肠癌进展过程中发挥着重要作用,其高表达预示着大肠癌患者预后不良,可作为诊断大肠癌的生物标志物及预测预后的重要因子,为大肠癌患者的早期诊断及预后评估提供新的理论依据。但KIF20A在大肠癌发生发展中的具体分子机制仍需进一步研究。