温度、照度和氮磷营养盐对长茎葡萄蕨藻富硒的影响

蔡 煜，刘东超，王晓梁，陈仁基，谢建华，吴靖匀



温度、照度和氮磷营养盐对长茎葡萄蕨藻富硒的影响

蔡 煜1,2，刘东超1,2，王晓梁1,2，陈仁基1，谢建华1，吴靖匀1

（1. 广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2. 广东省藻类养殖及应用工程技术中心，广东 湛江 524088）

【】探索富硒长茎葡萄蕨藻（）的培养条件。以亚硒酸钠（Na2SeO3）为硒源，采用单因素实验，研究不同硒浓度对长茎葡萄蕨藻的生长、光合色素和硒富集量的影响，通过正交实验，找出适宜长茎葡萄蕨藻富硒的最佳温度、照度和氮磷比组合条件。在亚硒酸钠0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L条件下，随亚硒酸钠添加量增加，藻体硒质量分数（干基）从1.70 µg/g增加至50.10 µg/g，且各组间差异均有统计学意义（＜0.05）；亚硒酸钠添加量2.0 mg/L时，藻体硒质量分数达到11.7 µg/g；添加量大于2.0 mg/L时，显著抑制藻体的生长（＜0.05），藻体叶绿素 a和叶绿素 b含量显著性降低（＜0.05）；添加量低于2.0 mg/L时，藻体的生长、叶绿素a和叶绿素b含量均无显著性差异；类胡萝卜素含量各组间无明显变化。在培养液亚硒酸钠质量浓度为2.0 mg/L的条件下，藻体最适的生长条件组合是温度28℃、照度2 000 lx、氮磷比10∶1，藻体的最优富硒条件是温度24 ℃、照度2 000 lx、氮磷比8∶1。长茎葡萄蕨藻在开发含硒安全性功能海藻食品方面有较大应用潜力。

长茎葡萄蕨藻；富硒量；环境因子；亚硒酸钠

硒是人体必需生命元素，在人和动物体中以硒代半胱氨酸（SeCys）形式参与构成谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），从而清除体内过多的活性氧自由基[1-5]。天然食物中硒含量普遍较低，人体缺硒可能诱发“大骨节病”和“克山病”等多种疾病[6]。中国营养学会推荐的中国居民成人膳食硒的摄入量(RNI)为60 µg/d[7]，而我国大部分地区是缺硒地带[8]。所以，通过提高功能食品中的硒含量成为研究热点之一。应用增硒技术提高作物的含硒量以满足人体需要，在设计新的对消费者发挥正向健康获益的功能食品时，富硒藻可能较为实用[9]。目前关于藻类富硒的报道中，小球藻（）、球石藻（）和螺旋藻（）等研究较为深入[10]，至于大型海藻对硒的吸收近几年方引起关注[11]，且主要对龙须菜（）、石莼（）等少数大型食用藻类有过富硒研究[12-13]；但大型海藻对硒的富集机理及相关环境因子对其影响鲜见系统报道。

长茎葡萄蕨藻（）是一种可食用大型经济海藻，含有丰富的氨基酸、多不饱和脂肪酸、维生素、可溶性膳食纤维以及磷、钙、镁、锌等矿物质元素[14-15]，有抗氧化、抗癌、抗肿瘤、抗糖尿病等作用[16]，营养价值高，如能增强其藻体的硒含量，提高其附加值，对于藻体生产和人体健康均有重要意义。笔者通过在长茎葡萄蕨藻的培养液中添加亚硒酸钠（Na2SeO3），探索藻体的富硒能力，为富硒的海藻功能食品培养提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 长茎葡萄蕨藻藻种

长茎葡萄蕨藻为深圳市蓝汀鼎执生物科技有限公司2017年12月养殖藻种，用消毒海水冲洗后，置于广东海洋大学水产学院藻类资源开发与养殖环境生态修复实验室进行充气暂养。培养条件：温度（26 ± 1）℃、照度（2 000 ± 100）lx、光暗周期12∶12、盐度 31 ~ 32，pH 7.8 ~ 8.2。

1.2 硒浓度实验设计

1.2.1 实验材料和药品准备 选择健康的长茎葡萄蕨藻，经消毒海水冲洗后再用无菌解剖剪将其直立枝修剪成长（40±2）mm的藻体，放入消毒的储物箱中暂养24 h备用，培养条件同1.1。

亚硒酸钠（纯度99.75%）、硝酸钠、磷酸二氢钾均为国产分析纯。

1.2.2 分组培养 根据预实验结果，亚硒酸钠质量浓度梯度设置为0（对照组）、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L。每组基础培养液为消毒自然海水添加0.5 mmol/L NaNO3和0.1 mmol/L KH2PO4。挑选暂养后的健康藻体，按其鲜品质量随机分至 6 个实验组，每个实验组设 3个平行组，每个平行组 4 株藻体，置于 PP 塑料盒中，在光照培养箱（GXZ-2800，宁波江南仪器厂）中按1.1条件培养7 d。每3 d换水1次，换水量100%。测量相关指标，分析确定最佳亚硒酸钠添加浓度，并将此浓度值作为温度、照度和氮磷比实验中亚硒酸钠的添加值。

1.3 单因子实验设计

根据长茎葡萄蕨藻的适宜生长条件，并结合文献[17-18]确定温度、照度和氮磷比的实验梯度。

1.3.1 温度实验 设置温度梯度为 20、22、24、26、28℃，每个梯度设置3个平行组，其他培养条件同 1.1。

1.3.2 照度实验 设置照度梯度为2 000、4 000、6 000、8 000 lx，每个梯度设3个平行组，其他培养条件同 1.1。

1.3.3 氮磷比实验 设置氮磷比为 5∶1（0.5、0.1 mmol/L）、8∶1（0.40、0.05 mmol/L）、10∶1（0.50、0.05 mmol/L）、16∶1（0.400、0.025 mmol/L）、24∶1（0.880、0.037 mmol/L），每个梯度设置3个平行组，其他培养条件同1.1。

1.3.4 分组培养 挑选经暂养恢复后的健康藻体，称量质量，按鲜品质量随机分组，分别添加最适Na2SeO3，其他条件同1.2.2。

1.4 正交实验设计

在单因子实验基础上，选择1.3实验分别得出的最适温度、照度和氮磷比进行3因素3水平正交实验，每个处理分别设置3个平行，具体步骤参照1.2.2。

1.5 指标测定

培养结束后，用分析天平准确称藻体鲜品总质量（7），计算藻体的特定生长率。将藻体放在60℃烘箱中干燥12 h，通过研磨—消解—赶酸进行样品的前处理，用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，型号7500cx，安捷伦科技有限公司）测定藻体的硒含量。参照李合生方法[19]测定藻体光合色素。

1.6 数据统计与分析方法

特定生长率 SGR（%·d–1）[17]、光合色素含量（mg/g）[19]、藻体（干物质）硒含量(Se)计算：

特定生长率 = [100 ln（m/0)] /。

(chl_a)=[13.95(665 nm)–6.88(649 nm)] ·/；

(chl_b)=[24.96(649nm)–7.32(655nm)] ·/；

类胡萝卜素质量分数={[1000(470nm)– 2.05(chl_a) – 114.8(chl_b)] / 245}/；

总叶绿素（T）=(chl-a) +(chl-b)。

(Se)= [(–0)s] / (s×1 000)

式中，0为初始鲜质量（g）；m为终末鲜质量（g）；为实验周期（d）。(nm)为色素溶液在nm 处的光密度，为色素溶液的总体积（L），为藻体质量（g）。为试样消化液测定浓度（µg/L）；0为空白消化液测定浓度（µg/L）；s为试样质量（g）；s为试样消化液总体积（mL）。

用 SPSS23.0 分析实验数据，结果以平均值±标准误表示，并作方差分析和 Duncan 多重比较，< 0.05 时差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同浓度亚硒酸钠对长茎葡萄蕨藻硒的富集、生长和光合色素影响

图1A表明，藻体富硒量随培养液中亚硒酸钠添加量的增加而增加，富集量（干基）从1.70 µg/g增加至50.10 µg/g，提高近30倍，且各组间差异均有统计学意义（＜0.05）。添加亚硒酸钠质量分数为0 ~ 2.0 mg/L时，藻体特定生长率差异无统计学意义（> 0.05）；添加量大于4.0 mg/L时，藻体生长受到抑制，特定生长率与对照组相比差异有统计学意义（＜0.05）（图1B）。图1C表明，培养液中亚硒酸钠质量浓度大于4.0 mg/L时，叶绿素 a和叶绿素b含量显著性降低（＜0.05）；各组间类胡萝卜素含量无明显变化（> 0.05）。

综合分析长茎葡萄蕨藻生长以及藻体含硒量，培养液中添加2.0 mg/L的亚硒酸钠较适于长茎葡萄蕨藻富硒培养。

凡含一个相同字母则组间差异有统计学意义（P>0.05）

2.2 温度对长茎葡萄蕨藻硒的富集、生长和光合色素影响

图2A表明，在实验温度范围内，藻体硒质量分数（干基）在22℃时最高，达17.78 µg/g，与其他组差异有统计学意义（＜0.05）；26℃（富硒量11.47 µg/g）、28℃组（富硒量11.28 µg/g）含硒量较24℃组（富硒量13.84 µg/g）显著降低（＜0.05）。图2B表明，温度高于20℃时，藻体特定生长率随温度的升高而升高，且各组间差异有统计学意义（＜0.05）。图2C可见，随温度的升高，藻体光合色素含量有升高趋势，温度为28℃时，各色素含量平均值最高，叶绿素 a含量与20、22、24℃组相比差异有统计学意义（＜0.05）；叶绿素b及类胡萝卜素含量，较20 ℃、22℃组显著性升高（＜0.05）。

综合分析长茎葡萄蕨藻生长及藻体含硒量，24~28℃的温度范围较适于长茎葡萄蕨藻富硒培养。

凡含一个相同字母则组间差异有统计学意义（P>0.05）

2.3 照度对长茎葡萄蕨藻硒的富集、生长和光合色素影响

图3A表明，照度在2 000 lx时含硒量（干基）最高，达到15.31 µg/g，与高照度6 000 lx（富硒量13.87 µg/g）、8 000 lx（富硒量13.64 µg/g）组比较，存在显著性差异（＜0.05）。图3B可见，随着照度的增加，藻体生长率显著性降低，且各组间有显著差异（＜0.05）。图3C表明，2000 lx时，藻体叶绿素 a和叶绿素 b含量最高，与高照度8 000 lx组有显著差异（＜0.05）；类胡萝卜素含量各组间无显著性差异。

综合分析长茎葡萄蕨藻的生长及藻体含硒量， 2 000 ~ 6 000 lx为长茎葡萄蕨藻富硒培养的适宜照度范围。

凡含一个相同字母则组间差异有统计学意义（P>0.05）

2.4 不同氮磷比例对长茎葡萄蕨藻硒的富集、生长和光合色素影响

图4A表明，各氮磷比组间藻体硒质量分数差异无统计学意义（＞0.05），表明氮磷比对长茎葡萄蕨藻硒的富集无影响。图4B表明，氮磷比为8∶1和10∶1时，藻体生长率升高，与其他组差异有统计学意义（＜0.05）。图4C表明，各组藻体叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量差异均无统计学意义（＞0.05）。

综合分析长茎葡萄蕨藻的生长以及藻体的含硒量，氮磷比在5∶1 ~ 10∶1是培养富硒长茎葡萄蕨藻的适合氮磷比范围。

凡含一个相同字母则组间差异有统计学意义（P>0.05）

2.5 正交实验结果

表1可见，特定生长率24℃实验组较低，而藻体的富硒量24℃实验组较高，而总叶绿素含量在各温度组中（实验组3和8除外）差异不明显。通过对特定生长率、富硒量和总叶绿素含量进行一般线性模型分析，分别得到单因素统计量X（特定生长率）、Y（富硒量）和Z（总叶绿素）值。比较温度、照度和氮磷比的X值，不同温度对应的值间差异有统计学意义（＜0.05），温度为28 ℃时，值最大；不同照度对应的值间差异显著（＜0.05），照度为2 000 lx时，值最大；不同氮磷比为对应的值间差异显著（＜0.05），氮磷比为10∶1时，值最大；分析X的极差值R，其大小为温度＞氮磷比＞照度。

表1 正交实验 L9 (33) 结果

注：1、2、3和1、2、3和1、2、3分别表示不同水平下长茎葡萄蕨藻特定生长率、富硒量和总叶绿素含量的均值，、和分别表示、和的极差值；数据为平均值±标准差（= 3）。

Note:1.2.3,1.2.3, and1.2.3represent the average of selenium, specific growth rate, and total chlorophyll content of long-stemmed grape fern at different levels, respectively.,, andrepresent the range of,and, respectively; date are`± SD (= 3).

比较温度、照度和氮磷比的Y值，不同温度对应的值间差异显著（＜0.05），温度为24 ℃时，值最大；不同照度对应的值间差异不明显（＞0.05），照度为2 000 lx时，值最大；不同氮磷比对应的值间无显著性差异显著（＞0.05），氮磷比为8∶1时，值最大；分析Y的极差值R，其大小为温度＞照度＞氮磷比。

比较温度、照度和氮磷比的Z值，不同温度、照度和氮磷比对应的Z值间均无显著性差异（＞0.05），；温度、照度和氮磷比分别为28 ℃、2 000 lx和5∶1时，其对应的值最大；分析Z的极差值R，其大小为温度＞氮磷比＞照度。

温度对藻体富硒的影响最大，24 ℃富硒效果最好，为30.06 µg/g；其次为照度，2 000 lx时藻体生长情况最优，其富硒量最高，为17.26 µg/g；最后是氮磷比，虽然各组对藻体富硒没有显著性差异，但比例为8∶1时含量最高，为17.28 µg/g。

温度28 ℃、照度2 000 lx、氮磷比为10∶1是适宜长茎葡萄蕨藻生长的最优组合；温度 24 ℃、照度2 000 lx、氮磷比为8∶1是适宜长茎葡萄蕨藻富硒的最优组合。

3 讨论

3.1 不同浓度亚硒酸钠对长茎葡萄蕨藻富硒量、生长和光合色素影响

硒对藻类有双重影响，低浓度硒有促进作用，高浓度硒则会影响藻类的生理过程，产生抑制、甚至致死效应[20-23]。刘静雯等[24]研究发现，当培养液中亚硒酸钠浓度大于20 µmol/L时，海洋球石藻（）的生长受到明显抑制，球石藻的最佳富硒浓度为f/2培养基的本底硒浓度（3.2 nmol/L），在该条件下培养1周，细胞中硒含量（干基）可达6 475 µg/g。大型海藻富硒研究也表明，裂片石莼（）和龙须菜（）可有效积累硒，并将亚硒酸钠转化成有机硒，最佳亚硒酸钠质量浓度分别是200、500 mg/ L，最高富硒量均可超过400 µg/g[12-13]；日本真海带（）在含200 mg/L亚硒酸钠的海水中培养56 h后测得海带的总硒（干基）为24.481 µg/g[25]；低浓度亚硒酸钠可有效提高龙须菜（）与细基江蓠（）的产量及营养物质含量[26]。在本实验条件下，长茎葡萄蕨藻在Na2SeO3质量浓度达2 mg/L时，硒富集量（干基）达11.70 µg/g，低于2 mg/L时未能促进藻体生长，可能是由物种差异所致。硒在细胞内会参与合成GSH-PX,在藻体的抗氧化系统中有清除氧自由基等作用，可促进藻体的生长[10]，但在长茎葡萄蕨藻中的作用效果并无石莼等明显，对藻细胞活力的提升并不大，所以不能促进藻体生长，提高藻体产量。Na2SeO3质量浓度超过4 mg/L时，开始抑制藻体生长，藻体在高浓度硒的逆环境中，可继续吸收环境中的无机硒，最高富硒量（干基）可达50.10 µg/g，硒富集量随着硒浓度升高而增加。长茎葡萄蕨藻耐受亚硒酸钠能力明显低于裂片石莼和龙须菜，是否由藻种间差异所致有待进一步研究，但含硒量明显高于唐贤明等[27]报道的天然长茎葡萄蕨藻含硒量7.53 µg/g。长茎葡萄蕨藻在高硒（Na2SeO3）环境下时，藻体硒的富集量升高，但生长受到抑制。可能有2种原因：一是由于硒取代含硫氨基酸中的硫生成硒代氨基酸，再被结合于蛋白质中，硒一旦过多取代蛋白质半胱氨酸、胱氨酸或蛋氨酸中的硫，即可能引起蛋白质空间结构和功能的改变，包括酶失活，从而使正常生命活动紊乱，抑制藻细胞的生长[28]；二是与活性氧形成的能力有关，硒化合物既可清除自由基，又可产生自由基。在高浓度下以产生自由基（活性氧）为主，自由基过多，不能及时清除则导致毒性作用[29]。同时在硒胁迫下，藻体能量传递受阻，传递效率降低，使得藻体叶绿素a和叶绿素b含量在高浓度硒环境下有所降低。环境硒浓度对藻体类胡萝卜素含量的影响较小，可能是由于藻体中类胡萝卜素未参与机体在硒胁迫环境所进行的抗氧化活动。关于驯化的长茎葡萄蕨藻是否会提高对亚硒酸钠的耐受量，亚硒酸钠添加次数、长茎葡萄蕨藻生长阶段是否影响富硒量等有待进一步研究。

3.2 温度对长茎葡萄蕨藻富硒量、生长和光合色素影响

温度是影响藻体生长和富硒的重要因素，高温可促进藻体的生长，但同时抑制藻体对Se的富集。有研究表明，在培养液亚硒酸钠质量浓度为0.4 mg/L条件下，螺旋藻在35℃时生长率最高，温度低于25℃时螺旋藻富硒量最大[30]。可能有2种原因：一是在较低温度条件下，藻类生长缓慢，有助于藻类适应硒环境并富集硒；二是藻体中与富硒活动有关的酶在高温条件下失活，富硒能力下降[31-33]。本研究中，长茎葡萄蕨藻在26℃和28℃环境下生长较佳，但富硒量低，22℃时生长缓慢，富硒量较高，也说明低温有利于藻细胞对硒的累积。随温度的升高，逐步达到藻体的最适生长温度，藻体的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量逐渐升高，可能是由于在低温下参与光合作用相关酶活性降低，色素会分解。温度升高，藻体生长快速，光和效率升高，光和色素含量升高。

3.3 照度对长茎葡萄蕨藻富硒量、生长和光合色素影响

照度是影响藻类生长和物质积累的重要环境因子之一。低照度会减弱藻细胞的光合作用，从而降低细胞新陈代谢，进而影响藻细胞对离子的富集；随着照度的增大，藻细胞光合作用增强，藻细胞对离子的富集量增加，但照度太高则不利于藻类的生长以及对营养盐的吸收利用。高海洋等[34]研究表明，照度10 000 lx时螺旋藻的硒富集量低于8 000 lx。本研究中，长茎葡萄蕨藻最佳的生长照度和最适富硒照度均为2 000 lx，在此照度下一方面可促进藻细胞的生长，藻体光合速率加快，叶绿素a和叶绿素b含量升高；另一方面又有利于硒在藻体中的累积。照度太高，藻体生长受抑制，生理系统紊乱，不利于藻细胞对硒的吸收。而照度变化对藻体类胡萝卜素影响较小，可能是由于照度改变时，藻体对硒的吸收和环境因子同时发生变化下，藻体启动抗氧化系统，但类胡萝卜素在系统中并未参与或产生的作用小，含量的变化不明显。

3.4 氮磷比对长茎葡萄蕨藻富硒量、生长和光合色素影响

海藻生长对营养盐需求较高，不同氮磷比对海藻生长和Se富集量有一定影响。研究表明，不同N、P营养盐会影响海带对硒的富集，营养盐浓度适宜时，海带对硒的富集能力提高，但高浓度P会抑制海带对硒的富集，可能是由SeO32-与PO43-相互的拮抗作用所致[25]。有学者认为Se与P有化学相似性，并在藻体中转运途径相同，所以藻类对两者的吸收有竞争性，P浓度一旦增加，其对硒的吸收则被抑制[35-38]。N、P等营养元素的添加，对植物的生长有较大促进作用，但多数离子间有较大的协同或拮抗作用[39-42]。本研究中，在不同氮磷比条件下，藻体的硒富集量和光合色素均无显著性差异，可能是由于N和P的浓度梯度差距太小，N、P和Se 3种离子间相互作用不明显，对藻体光合作用的影响较小；或是N、P对Se的吸收出现反方向作用，导致富集量不显著。氮磷比在8∶1和10∶1时藻体可更好地吸收N、P，藻体生长较为迅速。

综上，长茎葡萄蕨藻可大量富集硒，温度24℃、照度2 000 lx 、氮磷比8∶1是培养富硒长茎葡萄蕨藻的最优条件组合。长茎葡萄蕨藻在开发富硒安全性功能海藻食品方面有较大应用潜力。

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Effect of Temperature, Illuminance and Nitrogen-Phosphorus Ratio on Selenium Enrichment in

CAI yu1,2, LIU Dong-chao1,2, WANG Xiao-liang1,2, CHEN Ren-ji1, XIE Jian-hua1, WU Jing-yun1

（1.,524088; 2.,524088,）

To explore the culture conditions of high value-added selenium-enriched. 【】Using sodium selenite (Na2SeO3) as the selenium source, the effects of different selenium concentrations on the growth, photosynthetic pigments and selenium enrichment ofwere studied by single factor experiment. The orthogonal experiment was designed to find the optimum conditions for the temperature, illuminance and N/P ratio of selenium-enriched. 【】 The sodium selenite in culture solution was in the range of 0 to 8.0 mg/L. With the increase of selenium concentration, the selenium contents of algae (dry weight) increased from 1.70 μg/g to 50.10 μg/g. There was a significant difference among the groups (< 0.05). When the content of sodium selenite was 2.0 mg/L, the selenium contents of algae reached 11.7 μg/g. When selenium concentration was higher than 2.0 mg/L, the growth of algae was significantly inhibited (< 0.05), and the contents of chlorophyll a and chlorophyll b were significantly decreased (< 0.05). When selenium concentration was less than 2.0 mg/L, there was no significant difference in the growth, and contents of chlorophyll a and chlorophyll b. There was no significant change in carotenoid content among the groups. The optimal combination for cultivatingwas when selenium concentration was 2.0 mg/L, the temperature was 28 ℃, the illumination was 2 000 lx and the N/P ratio of 10∶1. The optimal selenium-rich conditions for algae were as follows: temperature 24 ℃, illumination 2 000 lx and N/P ratios 8∶1.【】has great potential in the development of seaweed foods containing selenium safe functions.

Sodium selenite;;Selenium enrichment

S968.4

A

1673-9159（2019）03-0046-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.007

2019-01-23

广东省科技计划项目（2015A020209167）

蔡煜（1993―），男，硕士，主要从事藻类生理生态学研究。E-mail:caiy0628@163.com

刘东超（1963―），男，副教授，主要从事藻类生理生态学研究。E-mail: dongchaoliu696@hotmail.com;

蔡煜，刘东超，王晓梁，等. 温度、照度和氮磷营养盐对长茎葡萄蕨藻富硒的影响[J]. 广东海洋大学学报，2019，39（3）：46-53.

（责任编辑：刘庆颖）