UPLC法同时测定霍山黄大茶中儿茶素及咖啡因的含量

胡华萍 孙磊 王艳芬 等

摘要 [目的]建立同时测定霍山黄大茶中5种儿茶素类成分及咖啡因的UPLC定量分析方法。[方法]采用梯度洗脱法同时测定EC、ECG、EGC、EGCG、GC、caffeine，选用Waters BEH C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm），流动相为乙腈-甲酸-水梯度洗脱，体积流量为0.2 mL/min，柱温设为30 ℃，检测波长210 nm。[结果]测定了霍山黄大茶中儿茶素类和咖啡因的含量，EC、ECG、caffeine、EGC、EGCG和GC分别在相应范围内线性关系良好（r>0.999 5），平均回收率分别为98.82%、97.30%、96.96%、96.59%、98.89%和100.11%，RSD为1.0%～1.8%。[结论]该方法快速简捷、灵敏度高、重现性好，可用做霍山黄大茶质量分析方法。

关键词 霍山黄大茶;儿茶素类;咖啡因;UPLC分析

中图分类号 TS207.3文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）04-0202-03

Abstract [Objection]The research aimed to establish an UPLC method for determination of five elected catechins and caffeine in Huoshan Yellow Big Tea.[Method]The extracts of the tea by ultrasonic extraction was analyzed on a Waters BEH C18 column （2.1 mm × 100 mm，1.7 μm） with a mobile phase of acetonitrilewater （containing 0.5% formic acid） for gradient elution at 210 nm，flow rate was set at 0.2 mL/min.[Result]The content of catechins and caffeine in Huoshan Yellow Big Tea was determined.EC，ECG，caffeine，EGC，EGCG and GC had good linear relations in the corresponding range （r>0.999 5），and the average recoveries were 98.82%，97.30%，96.96%，96.59%，98.89%，100.11%，respectively.RSD was 1.0%-1.8%.[Conclusion]The method is quick and simple，has high sensitivity and good reproducibility，and can be used as a quality analysis method of Huoshan Yellow Big Tea.

Key words Huoshan Yellow Big Tea;Catechins;Caffeine;UPLC analysis

茶葉是山茶科植物茶[Camellia.sinensis （L.） O.Ktze]的芽叶，味苦、甘，性微寒[1]。茶叶誉为世界最为流行的健康饮料，乌龙茶、黑茶（普洱茶、茯砖茶等）在抗氧化、肝保护、降血糖等方面表现出较好的生理活性[2-5]。黄大茶属于轻度发酵茶，是从绿茶发展而来的，在加工过程中需要经过萎凋、杀青、闷黄、提香等工序，最终形成黄大茶特有的色泽油润，黄叶黄汤，滋味浓厚甜润，香气焦香浓郁[7-8]。绿茶味浓，收敛性强，黄茶滋味鲜浓醇爽，究竟是黄茶在闷黄过程中湿热条件下的高热反应还是微生物的参与使其生化成分会发生系列变化的缘故值得进一步的研究。该研究以霍山黄大茶（又名皖西黄大茶）为研究对象，利用UPLC色谱方法对其主要活性物质儿茶素类及咖啡因成分进行分析，建立一种快速测定霍山黄大茶中棓儿茶酸（GC）、（-）-表没食子酸儿茶素（EGC）、咖啡因（caffeine）、表儿茶素（EC）、（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和（-）-表儿茶素没食子酸酯（ECG）的含量测定方法。

1 材料与方法

1.1 试材 霍山黄大茶样品采购于安徽霍山县亨大茶业有限公司，经安徽农业大学李叶云博士鉴定;对照品EC、ECG、caffeine、EGC、EGCG和GC均来自于武汉天植生物技术有限公司，批号依次为CFN98781、CFN99570、CFN99004、CFN97549、CFN99569、CFN99137，纯度大于98%;乙腈（Tidea Co.Ltd），甲酸均为色谱纯，超纯水自制。

1.2 仪器 Waters Acquity UPLC 超高效液相色谱仪（ 美国Waters公司，配备Acquity UPLC QSM、Acquity UPLC Sample Manager FTN、Acquity UPLC PDA Detector 以及Empower 工作站）;FA2004型万分之一电子分析天平（上海精科天平）;CP225D型十万分之一电子天平（德国赛多利斯）;Milli-Q 纯水机（美国Millipore 公司）;KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）;Fz-02型二两装高速中药粉碎机（温岭市百乐粉碎设备厂）。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备。称取GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG 适量，精密称定。分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度分别为0.210、0.215、0.216、0.200、0.212和0.201 mg/mL的对照品贮备液。

1.3.2 供试品溶液的制备。黄大茶粉末（50目筛）0.25 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，加25 mL 70%甲醇溶液，室温下浸泡24 h后超声提取30 min，过滤，滤液加70%甲醇定容于50 mL容量瓶中，精密吸取5 mL滤液加70%甲醇定容至10 mL，0.22 μm滤膜滤过，即得。

1.3.3 色谱条件。色谱柱为waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流动相为乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B）梯度洗脱，洗脱程序为0～5 min，8～14% A;5～9 min，14～22.5% A;9～15 min， 22.5% A;15～17 min，22.5～8% A;17～23 min，8% A;体积流量为0.2 mL/min;检测波长为210 nm;柱温为30 ℃;进样量为2 μL。

1.3.4 线性关系考察。精密吸取“1.3.1”项下GC、ECG、EGC、EC、EGCG和caffeine对照品贮备溶液100、200、400、800、1 000、2 000 μL于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度线，摇匀。依照“1.3.3”色谱条件，记录色谱图，测量峰面积并记录。以对照品质量（X，μg）为横坐标、峰面积为纵坐标（A）绘制标准曲线，计算6种对照品线性回归方程。

1.3.5 样品含量测定。按照“1.3.2”方法制备各批次霍山黄大茶样品溶液，按照“1.3.3”方法进样，用外标法计算各物质含量，每个样品重复3次。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择 试验中尝试采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸-水、甲醇-甲酸-水等流动相系统，结果发现使用酸时，GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG分离度及对称性均良好，保留时间适中。同时发现乙腈-甲酸-水比甲醇-甲酸-水分离度更好，最后确定的流动相条件为乙腈-0.5%甲酸水梯度洗脱，色谱图见图1。儿茶素类化合物分子结构中含有多个酚羟基，加入甲酸后能有效的防止拖尾改善峰形。

2.2 标准曲线及线性范围 GC、ECG、EGC、EC、EGCG、caffeine的保留时间、线性回归方程、相关系数和线性范围见表1。结果表明，在相应的浓度范围内线性关系均良好。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验。

精密称取霍山黄大茶0.25 g，按“1.3.2”方法制备供试品溶液，连续进样 6次，记录色谱图，结果表明，GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG的色谱峰峰面积的RSD值分别为0.3%、1.0%、0.8%、0.9%、1.0%、0.8%，说明该仪器精密度好。

2.3.2 稳定性试验。

称取霍山黄大茶0.25 g，精密称定，按“1.3.2”方法制备供试品溶液。分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样1 次，外标法计算得样品中GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG含量的RSD 分别为0.4%、0.8%、0.5%、0.3%、1.0%、0.9%，表明供试品溶液中6种成分在24 h 内稳定。

2.3.3 重复性试验。

称取霍山黄大茶0.25 g，平行6份，精密称定，分别按“1.3.2”方法制备供试品溶液。按“1.3.3”进样测定。计算各供试品中GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG含量的RSD值分别为0.8%、1.0%、1.1%、1.0%、0.2%、0.3%，说明该方法重复性良好，符合定量分析的要求。

2.3.4 回收率试验。

精密称取已知6种被测成分含量的黄大茶样品约0.1 g，平行6份，每组分别按黄大茶中GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG含量的100%，加入对照品溶液，按“1.3.2”方法制备供试品溶液，在“1.3.3”色谱条件下进样测定，计算回收率及其RSD。结果见表2，各成分的平均回收率为96.59%～100.11%，RSD为1.0%～1.8%，表明这6种化学成分加样回收率符合定量分析要求。

2.4 样品含量测定

利用上述建立的方法，对霍山亨大茶叶有限公司2016年生产的6批（S1～S6）霍山黄大茶中儿茶素及咖啡因进行含量测定。从测定并计算的黄大茶药材中GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG含量（表3）可看出，霍山黄大茶中儿茶素类成分含量最高的为EGCG，这与其他类型茶叶测得的结果相吻合[8-9]。

3 讨论与结论

儿茶素类化合物分子结构中含有多个酚羟基，极性较大且显示一定的酸性，分离存在一定的难度。因此，该研究尝试在流动相系统中添加一定量的甲酸来改善其分离度，采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸-水、甲醇-甲酸-水等流动相系统，结果发现使用酸时，GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG分离度及对称性均良好，保留时间适中。同时发现乙腈-甲酸-水比甲醇-甲酸-水分離效果更好，最后最终选择乙腈-0.5%甲酸-水系统梯度洗脱。儿茶素类化合物在水中的溶解性并不好，温度和光线均能使发生氧化、聚合，通过单因素试验，考察提取溶剂、料液比、提取方法及提取时间等因素对所测几种化学成分的影响，最终确定供试品溶液的提取方法为冷浸24 h后，加70%甲醇，1∶50料液比，超声提取 30 min。

黄大茶为轻发酵茶，其采摘时间与加工过程有异于其他高端茶叶，其品质与茶树品质特性、采摘季节和加工工艺密切相关，其产生的生理活性与其内在成分又密切相关。儿茶素类化合物是茶叶的主要化学成分[10]，为天然高效低毒的抗氧化剂，同时在抑菌和神经保护方面表现出较好的活性;咖啡因是一种中枢神经兴奋剂，是茶叶中提神醒脑

的主要活性成分。试验借助超高效液相色谱的高速、灵敏和高分离度的特性，首次建立霍山黄大茶中儿茶素类及咖啡因快速分析方法，为霍山黄大茶的质量控制及后续的研究提供参考。

参考文献

[1] 谢宗万.全国中草药汇编（下册）[M].北京：人民卫生出版社，1996：438-439.

[2] WANG H J，SHI S S，BAO B，et al.Structure characterization of an arabinogalactan from green tea and its antidiabetic effect [J].Carbohyd Polym，2015，124：98-108.

[3] DALAR A，KONCZAK I.Phenolic contents，antioxidant capacities and inhibitory activities against key metabolic syndrome relevant enzymes of herbal teas from Eastern Anatolia [J].Ind Crop Prod，2013，44：383-390.

[4] ZHANG X，WU Z F，WENG P F.Antioxidant and hepatoprotective effect of （）epigallocatechin 3O（3Omethyl） gallate （EGCG3″Me） from Chinese Oolong tea [J].J Agric Food Chem，2014，62（41）：10046-10054.

[5] HAN M M，ZHAO G S，WANG Y J，et al.Safety and anti-hyperglycemic efficacy of various tea types in mice[J].Sci Rep，2016，6：31703.

[6] 李颖，董玉惠，张丽霞，等.不同闷黄方式对山东黄大茶品质的影响[J].中国茶叶加工，2015（3）：23-27.

[7] 李颖，朱磊，盖晓亚，等.不同杀青方式对山东黄大茶品质的影响[J].中国茶叶加工，2014（3）：29-32.

[8] WANG Y X，LI Q，WANG Q，et al.Simultaneous determination of seven bioactive components in Oolong tea Camellia sinensis：Quality control by chemical composition and HPLC fingerprints [J].J Agric Food Chem，2012，60（1）：256-260.

[9] 張琪，徐维玲，李翠芹.HPLC法同时测定茶叶中儿茶素类和咖啡因的含量[J].食品工业科技，2015，36（4）：53-56.

[10] 宛晓春.茶叶生物化学[M].北京：中国农业出版社，2003：9-15.