平喘宁对寒性哮喘大鼠PI3K/Akt信号通路相关信号分子表达的影响

孟 芝，方向明,2

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；2.中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012)

支气管哮喘(简称哮喘)主要症状是反复发作的喘息、气急、咳嗽、胸闷，发作时双肺可闻及哮鸣音，大多数患者可自行缓解或经平喘药物治疗缓解。平喘宁是治疗寒哮的临床经验方，由麻黄、半夏等11味中药组成，可温肺平喘、化痰止咳。本实验观察平喘宁干预寒哮模型，并采用实时荧光定量PCR法检测PI3K/Akt信号通路中叉头蛋白O1(forkhead box protein O1，FKHR)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、促凋亡蛋白Bad mRNA的表达水平，探讨平喘宁治疗哮喘的作用机制。

1 材料

1.1 动物 105只SD健康雄性大鼠，SPF级，体质量180～200 g，6～8周龄，由安徽医科大学动物实验中心[生产许可证号为SCXK(皖)2017-001]提供。

1.2 药品 地塞米松片(批号 015170401)：上海上药信谊药厂有限公司；桂龙咳喘宁胶囊(批号 180112)：桂龙医药(安徽)有限公司。平喘宁(由麻黄、细辛、浙贝母、陈皮、杏仁、黄芪、半夏、地龙、苏子、太子参、防风11味药组成)，购自安徽中医药大学国医堂中药房，饮片经煎煮、浓缩后，制成浓度分别为1.46、0.73、0.37 g/mL的药液，作为平喘宁高、中、低剂量组。

1.3 主要试剂 二甲苯(批号 20180310)、氯仿(批号 20161013)、异丙醇(批号 20160614)、无水乙醇(批号 20180410)：上海苏懿化学试剂有限公司；伊红染色液(批号 718011)、苏木素染色液(批号 718034)：Baso；Trizol(批号 90803)：Life technogies；DEPC-H2O(批号 1706G10)：Generay Biotech；逆转录试剂盒(批号 00519963)：Thermo Scientific。

1.4 主要仪器 生物组织自动脱水机、生物组织包埋机：湖北亚光医用电子技术有限公司；切片机：Leica；普通PCR仪：浙江省杭州晶格科学仪器有限公司；荧光定量PCR仪：Thermo Scientific；低速迷你离心机：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；高速台式冷冻离心机：安徽嘉文仪器装备有限公司。

2 方法

2.1 分组 随机将105只SD健康雄性大鼠分为正常组、模型组、平喘宁高剂量组、平喘宁中剂量组、平喘宁低剂量组、桂龙咳喘宁组、地塞米松组，共7组，每组15只。

2.2 模型复制 参考文献[1]复制寒哮模型，第1、8天，除正常组外的各组大鼠以1 mL的10%卵蛋白溶液(使用生理盐水溶解配制)腹腔注射进行致敏，第15天，以1%卵蛋白溶液对大鼠进行雾化，诱导哮喘，每次30 min，同时将大鼠放入可调节寒冷箱(0～2 ℃)中，给予寒冷刺激，每次2 h，每日1次，持续7 d，正常组大鼠腹腔注射和雾化药物均以生理盐水代替。大鼠逐渐出现喷嚏、呼吸急促、咳嗽、蜷缩扎堆、反应迟钝、畏寒、烦躁不安、身体颤抖、食量变小、被毛凌乱无光泽、大便稀溏等现象，说明模型复制成功[2]。

2.3 给药 第22天开始灌胃给药，平喘宁高、中、低剂量组分别按14.6、7.3、3.7 g/kg进行灌胃；地塞米松组将药片研碎溶于生理盐水后配制成溶液，按0.4 mg/kg进行灌胃；桂龙咳喘宁组按0.4 g/kg进行灌胃。正常组和模型组灌服等容积生理盐水。每日1次，灌胃28 d。

2.4 取材 灌胃结束后禁食24 h，以1%卵蛋白溶液再次雾化30 min，雾化后2 h内，对大鼠进行麻醉、处死，取肺组织，分离左右肺。左肺放入甲醛中固定，右肺放入冻存管中，-80 ℃保存。

2.5 病理检测 取出甲醛中固定好的肺组织，切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm大小的切块，进行脱水、包埋、切片。然后将切片用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色。最后中性树胶封片，在400倍光镜下观察大鼠肺组织的形态学变化。

采用实时荧光定量PCR检测Bad、FKHR、PKC mRNA的表达水平。①RNA提取：剪取50～100 mg肺组织，研碎，加入1 mL TRIzol裂解组织，然后离心去除未完全裂解的组织；加入0.2 mL氯仿，离心，取上清液；加入0.5 mL异丙醇，弃上清液；加1 mL 75%乙醇，弃上清液；室温放置30 min，加20～50 μL焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)水, 55 ℃下促溶10 min，-80 ℃保存。②RT反应：1 μg RNA、10 μmol/L Oligo(dT)1 μL、DEPC水补足至12 μL，点动离心；在PCR仪上65 ℃加热5 min，冰浴3 min；加5×反应缓冲液4.0 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、Revert AidTMM-MuLV 反转录酶 1 μL、RibolockTMRNA酶抑制剂1 μL，PCR仪上42 ℃加热60 min，70 ℃ 5 min；上述反应液即为cDNA，-80 ℃保存。③PCR反应：cDNA作为荧光定量模板，反应体系2×SYBR Green mixture 5 μL、10 μmol/L正向引物(见表1)1 μL、10 μmol/L反向引物(见表1)1 μL、cDNA 1 μL、去RNA酶水2 μL，反应条件为95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s、60 ℃ 10 s，共40个循环。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司设计(见表1)，计算方法为2-ΔΔCt。

表1 实时荧光定量PCR引物

3 结果

3.1 各组大鼠肺组织病理变化比较 正常组大鼠肺组织无明显炎症细胞浸润，支气管结构基本完整，管壁无明显增厚。模型组大鼠支气管结构明显紊乱，管壁明显增厚，气道上皮细胞脱落，有炎症细胞浸润，黏膜充血。药物治疗组大鼠肺组织病理变化均有所改善，其中平喘宁高、中剂量组改善程度优于平喘宁低剂量组。见图1。

注:A.正常组;B.模型组;C.平喘宁高剂量组;D.平喘宁中剂量组;E.平喘宁低剂量组;F.地塞米松组;G.桂龙咳喘宁组

图1各组大鼠肺组织形态学变化(HE染色，10×40倍)

3.2 各组大鼠肺组织PKC、Bad、FKHR mRNA表达水平比较 与正常组比较，模型组PKC mRNA表达水平显著增高(P<0.05)，Bad mRNA、FKHR mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，各药物治疗组PKC mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，Bad mRNA、FKHR mRNA表达水平显著增高(P<0.05)；平喘宁对PKC、Bad、FKHR mRNA表达的效应具有剂量依赖性，在降低肺组织PKC mRNA表达水平，升高FKHR、Bad mRNA表达水平方面，平喘宁高剂量作用最优(P<0.05)；地塞米松组与平喘宁高剂量组Bad mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但地塞米松组大鼠体形消瘦，状态萎靡，不良反应较明显。见表2。

表2 各组大鼠肺组织PKC、Bad、FKHR mRNA相对表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与地塞米松组比较，△P<0.05；与桂龙咳喘宁组比较，◇P<0.05；与平喘宁低剂量组比较，□P<0.05；与平喘宁中剂量组比较，○P<0.05

4 讨论

哮喘是常见的慢性病之一，是由细胞组分和多种细胞(如嗜酸粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞)参与的气道慢性炎症性疾病。其发病机制主要与气道重构、气道免疫-炎症机制、神经调节机制、气道高反应性有关。哮喘发作受饮食、药物和环境等多因素影响，且具有遗传倾向。中医认为哮喘的主要病理因素是“痰”，因多种因素引动“伏痰”而发病，是哮喘发作的“夙根”。

平喘宁是治疗寒哮的经验方，由三子养亲汤和射干麻黄汤加减而来。其中麻黄发汗解表、宣肺平喘，主要成分麻黄碱能缓解气管平滑肌的痉挛，解热、发汗、镇咳平喘[3-4]；苦杏仁是治咳喘要药，能降肺气、止咳平喘，此外还有调节免疫功能的作用[5]；陈皮理气化痰，有祛痰平喘、扩张支气管血管作用[6]；浙贝母化痰散结，可止咳祛痰、松弛平滑肌[7]；防风祛风止痉，现代研究发现其还有抗炎、抗过敏作用[8]；细辛温肺化痰，其主要成分能减轻支气管痉挛[9]；黄芪、太子参补脾肺之气，可增强机体免疫力[10-11]；半夏健脾化痰，所含的生物碱和有机酸具有镇咳、祛痰等药理作用[12]；地龙可解痉通络、清肺平喘，有研究发现地龙还有逆转和防治气道重构的作用[13]；苏子降肺气、化痰涎，有镇咳、平喘等药理作用[14]。全方以温肺平喘、止咳化痰药为主，以理气补虚药为辅，升降相宜，标本兼治，配伍精炼。功能温肺化痰，止咳平喘，主治寒哮证。

PI3K/Akt通路在细胞的分化、增殖、凋亡等方面有重要作用[15]。PI3K被激活后，产生PIP3，PIP3能够激活Akt，Akt活化后可以调控下游蛋白，对细胞生长、凋亡进行调节[16]。研究发现，PI3K/Akt信号通路阻断后，可以抑制气道结构改变，减少炎症细胞浸润及减轻气道高反应，改善哮喘症状[17]。Bad是促凋亡蛋白，属Bcl-2家族成员，可与Bcl-2或Bcl-xl结合促进细胞凋亡，而磷酸化的Bad(p-Bad)不再发挥促凋亡作用。Akt是Bad激酶之一，能够磷酸化Bad，阻断Bad促细胞凋亡功能[18]。孙磊明[19]研究表明，p-Bad相对含量与气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)凋亡负相关，而ASMCs凋亡减少参与哮喘气道重塑。FKHR属FOXO(forkhead box,class O)家族，可以激活细胞周期负性调节因子P27来调控细胞周期，抑制细胞增生；还可以上调FasL、Bim、TRAIL等促凋亡因子的表达，促进细胞凋亡[20]，FKHR受PI3K/Akt的负向调控，Akt可以磷酸化FKHR，使其无法发挥其功能[21]。研究表明，FKHR可以抑制肺癌细胞周期并能促进癌细胞的凋亡[22-23]。PKC是一种多功能蛋白，在细胞中大多无活性，激活后可以调控细胞的增殖分化和凋亡，促进炎症因子释放。有研究表明，PKC对气道平滑肌的增值、分化具有重要作用[24]，PKC表达降低能够减轻哮喘大鼠的气道炎症[25]，PKC还可以调节T细胞因子平衡，减轻气道炎症，改善哮喘[26]。

本实验结果显示，平喘宁高剂量组对PKC、FKHR、Bad mRNA的作用较其他组明显。结果表明，平喘宁能够调控信号通路PI3K/Akt中PKC、FKHR、Bad的表达水平，使肺组织炎症浸润减少，气道平滑肌增殖得到抑制，减轻炎症反应和气道重塑，从而治疗哮喘。