三七破壁饮片质量分析

梁 笑，徐国兵,2，钱珊珊，桂双英,4,5，王举涛，葛 鼎，剧梦真，鲍炳娟

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 230051；3.安徽中医药大学第二附属医院药学部，安徽 合肥 230061；4.安徽省中医药科学院药物制剂研究所，安徽 合肥 230012；5.安徽道地中药材品质提升协同创新中心，安徽 合肥 230012)

三七为五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F. H. Chen]的干燥根和根茎，具有散瘀止血、消肿定痛等功效，主治咳血、吐血、衄血、便血、崩漏、外伤出血、胸腹刺痛、跌扑肿痛[1]。其始载于《本草纲目》，其卷三(上)中记载将三七与米泔同服可治吐衄[2]，明医书《证治准绳》中记载将三七晒干取粉同槐枝、血竭等入药可治疗跌伤[3]。在现代中医临床中，三七可煎汤、研末或入丸(散)内服，亦可研末、磨汁外用。与传统研磨而成的三七粉相比，三七破壁饮片是运用超微粉碎技术将传统三七饮片进行细胞级粉碎并制粒而成的一种新型中药饮片，在使用上可不必煎煮直接冲泡服用，配伍灵活，应用便捷。其在保留传统饮片中所有成分的同时，又提高了有效成分的溶出速度和溶出度。本研究开展三七破壁饮片的质量研究，为三七破壁饮片质量标准的建立提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，配备四元泵、自动进样器及可变波长检测器；电子天平(PA1004B)：上海精科天美；Varian cary50紫外可见分光光度计：美国VARIAN公司；BT-9300H激光粒度仪：江苏省丹东市百特仪器有限公司；暗箱式薄层色谱摄影仪GoodSee-Ⅱ：上海科哲生化科技有限公司；光学显微镜(NIKON E100)：北京泰克仪器有限公司；原子吸收分光光度计(A3AFG-12)：北京普析通用仪器有限责任公司；微波消解仪(MD6H)：奥普勒仪器有限公司。

1.2 材料 三七破壁饮片(三七破壁粉碎后，经乙醇粘合制粒，批号 170801-170810)：安徽亳州宏信药业提供；三七对照药材(批号 120941201108)、人参皂苷Rb1(纯度 95.0%，批号 110704201625)、三七皂苷R1(纯度 95.0%，批号 110745201619)、人参皂苷Rg1(纯度 91.7%，批号 110703201530)、人参皂苷Re(纯度 97.4%，批号 110754201626)：中国食品药品检定研究院；甲醇(色谱纯，≥99.9%，批号 Me-12760216)、乙腈(色谱纯，≥99.9%，批号 AC-12960217)：OCEANPAK；三氯甲烷(分析纯)：天津精强化工有限公司；乙酸乙酯(分析纯)：江苏省无锡市利宏化工产品有限公司；铅[100 μg/mL，批号GBW(E)080129]、镉[100 μg/mL，批号GBW(E)080119]、砷[100 μg/mL，批号GBW(E)080117]、汞[100 μg/mL，批号GBW(E)080124]、铜[100 μg/mL，批号GBW(E)080122)]：中国计量科学研究院；超纯水：由Millipore公司Milli-Q超纯水系统制备；Merck硅胶预制薄层板(Si-60，批号 HC43300156)：默克化工技术有限公司。

2 方法与结果

2.1 性状考察 灰褐色至灰黄色的颗粒，气微，味苦回甜。

2.2 显微鉴别 参考文献[4-5]方法进行显微鉴别：取本品粉末适量，加水合氯醛装片，必要时加热透化。显微镜下可见淀粉粒甚多，单粒圆形、半圆形或圆多角形，直径4～30 μm；树脂道碎片含黄色分泌物；导管碎片较少见。见图1。

图1三七破壁饮片显微结构(10×40倍；A.树脂道；B.导管；C.淀粉粒)

2.3 薄层色谱鉴别 取三七破壁饮片0.5 g，按2015年版《中华人民共和国药典》一部三七药材鉴别项下方法，制备供试品溶液和对照品溶液，加水5滴，搅匀，再加水饱和的正丁醇5 mL，密塞，振摇10 min，放置2 h，离心，取上清液，加3倍量正丁醇饱和的水，摇匀，放置使分层(必要时离心)，取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rg1对照品及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的混合溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法(2015年版《中华人民共和国药典》四部通则0502方法)试验，吸取上述两种溶液各1 μL，分别点于同一块Merck硅胶预制薄层板(Si-60)上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，上行展开17 cm，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液(1→10)，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置紫外光灯(365 nm)下检视，显相同的荧光斑点。10批样品按本法检验，均符合规定，且色谱分离效果好，斑点清晰，比移值适中，重复性好。薄层鉴别图见图2。

2.4 指纹图谱鉴别

2.4.1 色谱条件 按照文献[6-8]方法设定色谱条件。采用太玮科技JADE-PAK RS-C18Ⅱ色谱柱(250×4.6mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～10 min，10% A，90% B；10～20 min，10%～25% A，90%～75% B；20～35 min，25%～37% A，75%～63% B；35～45 min，37%～45% A，63%～55% B；45～50 min，45%～75% A，55%～25% B)，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长203 nm，进样量10 μL。

2.4.2 供试品溶液制备 取供试品0.5 g加入色谱甲醇25 mL，超声(40 kHz，200 W)提取0.5 h，过滤，转移至25 mL量瓶中，加色谱级甲醇定容，即得。

注：a、b、c、d、e分别代表批号170801、170802、170803、170804、170805的三七破壁饮片，f代表三七混合对照品(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别为人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1)，g代表三七对照药材，h、i、j、k、l分别代表批号170806、170807、170808、170809、170810的三七破壁饮片；左图为日光下薄层色谱图，右图为紫外光(365 nm)下薄层色谱图

图210批样品的薄层色谱图

2.4.3 对照药材溶液与对照品溶液制备 取三七对照药材粉末(过四号筛)0.5 g，依供试品溶液制备方法制备对照药材溶液，另取人参皂苷Rb1对照品、三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品，分别制成人参皂苷Rg1 0.4 mg/mL、三七皂苷R1 0.1 mg/mL、人参皂苷Rb1 0.4 mg/mL的对照品溶液。

2.4.4 空白实验 精密吸取空白甲醇溶液10 μL，在“2.4.1”项下色谱条件进样，溶剂峰很小且于5 min前出峰，表明空白溶剂对本实验无干扰。

2.4.5 精密度试验 按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样7次，记录色谱图。以三七皂苷R1为参照峰(S)，各主要色谱峰的相对峰面积及相对保留时间的RSD均小于4%，表明仪器精密度良好。

2.4.6 样品溶液稳定性 按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h进样，记录色谱图，以三七皂苷R1为参照峰(S)，考察各共有色谱峰的相对保留时间及相对峰面积RSD的一致性。结果表明，各共有色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于0.2 %，表明各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积无明显变化，供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.4.7 重复性考察 取同一批供试品6份，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，进样10 μL，记录色谱图，以三七皂苷R1为参照峰(S)，结果表明，6次重复试验的主要色谱峰面积及保留时间的RSD均小于5%，表明本方法重复性良好。

2.4.8 10批样品指纹图谱 取三七对照药材与三七破壁饮片(批号为170801-170810)，分别制备样品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样10 μL，记录色谱图，将色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以三七对照药材为参照图谱(R)，采用中位数法生成对照图谱后进行自动匹配，分析色谱图相似度。结果表明各批三七破壁饮片与三七对照药材相似度分别为0.990、0.986、0.994、0.928、0.931、0.960、0.947、0.996、0.879、0.994。见图3。

注：自下而上依次为对照药材(R)，批号依次为170801、170802、170803、170804、170805、170806、170807、170808、170809、170810的三七破壁饮片，S为参照峰三七皂苷R1

图310批三七破壁饮片样品指纹图谱

2.5 重金属测定 取三七破壁饮片0.5 g，按照2015年版《中华人民共和国药典》四部通则2321之铅、镉、砷、汞、铜测定法制备供试品溶液和标准品溶液，参考2015年版《中华人民共和国药典》四部通则0406原子吸收分光光度法以标准曲线法定量分析。因2015年版《中华人民共和国药典》(一部)三七药材项下无重金属检查项，参考西洋参项下重金属检查限度，三七破壁饮片重金属检查结果均符合规定，故不列入标准。见表1。

表1 三七破壁饮片样品重金属测定结果

2.6 未破壁细胞限度 称取供试品0.010 g，加入水合氯醛试液-水(1∶1)0.5 mL，超声处理至完全溶散，吸取所有溶液装片，每片以不溢出、无气泡、颗粒分布均匀为度，在100倍显微镜下检视，对直径大于100 μm且完整的细胞进行计数(如多个完整的细胞连成一片，且整片也超过100 μm者，以整片为一个进行计算)，10批样品的未破壁细胞数分别为53、62、55、74、59、61、52、66、81、46，显示每0.010 g三七破壁饮片未破壁细胞数均未超过100个。

2.7 粒径分布检查

2.7.1 遮光率对粒径测定的影响 以50%乙醇为分散介质，加入三七破壁饮片(批号 170801)，打开超声分散装置，待仪器读数稳定后记录遮光率与粒径分布D90值。结果表明，遮光率随加样量增加而增加，遮光率在10%～20%时粒径测量结果最优，因此以遮光率10%～20%作为三七破壁饮片粒径分布测定范围。见表2。

表2 遮光率对三七破壁饮片粒径分布D90值的影响

2.7.2 分散介质选择 取适量三七破壁饮片(批号 170802)样品，分别以纯化水、50%乙醇、100%乙醇为分散介质，加入样品池中，使遮光率为10%～20%，打开超声分散装置，待仪器读数稳定后记录结果，以D90值作为反映粒径分布均匀性的指标，三七破壁饮片在纯化水中粒径为38.26 μm，在50%乙醇中粒径为28.81 μm，纯乙醇中粒径为55.77 μm。结果表明，不同分散介质对粒径测定有一定影响，考虑到产品使用特性选择水作为分散介质。

2.7.3 三七破壁饮片样品粒径分布检查 取10批样品，以纯化水为分散介质，加入样品池中，使遮光率为10%～20%，打开超声分散装置，待仪器读数稳定后记录粒径分布D90值，结果分别为38.03、34.09、35.33、36.23、36.21、38.93、36.23、33.89、34.19、34.94 μm，平均值为35.81 μm。

2.8 含量测定

2.8.1 对照品溶液的制备 取人参皂苷Rg1对照品、三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇制成含人参皂苷Rg1 3 924.8 μg/mL、三七皂苷R1 1 206.5 μg/mL、人参皂苷Rb1 4 009.0 μg/mL的混合对照品溶液。

2.8.2 供试品溶液的制备 取样品约0.6 g，精密称定，精密加入甲醇50 mL，称定质量，放置过夜，置80 ℃水浴上保持微沸2 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.8.3 色谱条件 按照文献[9-12]方法设定色谱条件。色谱柱：太玮科技JADE-PAK RS-C18Ⅱ色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-超纯水(B)；梯度洗脱(0～12 min，19%乙腈；12～60 min，19%～36%乙腈)；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：203 nm；进样量：10 μL。

2.8.4 系统适用性试验 精密吸取供试品溶液、对照品溶液、空白甲醇各10 μL，注入液相色谱仪中，按“2.8.3”项下色谱条件进行分析，记录色谱图，见图4。结果表明各物质的分离度、理论塔板数、灵敏度与拖尾因子均达到要求。另精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样5次，记录色谱峰峰面积，各色谱峰峰面积RSD值均小于1.5%，结果表明本方法重复性良好。

注： 1. 三七皂苷R1；2.人参皂苷Rg1；3.人参皂苷Rb1

图4空白溶剂(A)、对照品溶液(B)、供试品溶液(C)的高效液相色谱图

2.8.5 线性关系考察 精密吸取“2.8.1”项下混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、10 mL，置10 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀。进样量10 μL，按“2.8.3”项下色谱条件进行分析，测定峰面积，计算回归曲线与方程。人参皂苷Rg1：A=3.634 9c-107.9，r=0.999 6；三七皂苷R1：A=3.269 4c-31.931，r=0.999 5；人参皂苷Rb1：A=2.537 4c-88.414，r=0.999 5。结果表明人参皂苷Rg1在0.392 5～392.5 μg，三七皂苷R1在0.120 7～120.7 μg，人参皂苷Rb1在0.400 9～400.9 μg范围内与峰面积的线性关系良好。

2.8.6 10批样品含量测定 取10批样品，按“2.8.2”项下方法制备样品溶液，并测定3种皂苷的含量(计算时已将对照品纯度纳入其中)，见表3。

3 讨论

3.1 质量控制指标 10批样品水分含量平均值为7.96%，总灰分含量平均值为3.08%，酸不溶灰分含量平均值为1.01%，未破壁细胞数平均值为60.9，粒径平均值为35.81 μm，按不高于平均量的20%制定标准。甲醇浸出物平均值为23.68%，10批三七破壁饮片指纹图谱相似度平均值为0.961，3种皂苷含量总和平均值为7.59%，按不低于平均量的80%制定标准。根据上述数据以及参考2015年版《中华人民共和国药典》三七项下含量测定标准，将本品水分拟定为不得过9.5%，总灰分拟定为不得过4%，酸不溶性灰分拟定为不得过1.5%，浸出物含量拟定为不少于19.0%。拟定在100倍显微镜下检视时，直径大于100 μm且完整的细胞数不得超过100个。三七指纹图谱鉴别样品与对照药材相似度不得小于0.8。粒径不得大于45.0 μm。拟定人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1含量之和不得低于6.0%。

表3 三七破壁饮片样品含量测定结果

3.2 薄层色谱的耐用性考察 实验中针对自制板和预制板的展开效果进行考察，结果显示自制硅胶G板中人参皂苷Rg1和三七皂苷R1分离度不能达到鉴别要求，预制板中各斑点分离度良好，色谱辨识度高；对不同的展开距离和展开温度条件进行考察，结果显示展距为10 cm时各斑点不能实现很好分离，展距为17 cm时，各斑点分离度相对较好，易于辨识；展开温度考察中，将薄层板分别置于6 ℃和室温环境展开，结果表明在不同温度下各斑点均可实现较好分离。

3.3 指纹图谱方法学考察 在指纹图谱方法学考察中，对供试品制备所用的提取方式、提取溶剂进行考察，比较超声提取和回流提取法，并考察甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、水饱和正丁醇这4种溶剂的提取效率，最终确定以甲醇为溶剂，超声(40 kHz，200 W)提取0.5 h。

中药饮片经超微破壁粉碎后，有效成分充分暴露，成分释放、溶出均显著加快[13-14]，但目前破壁饮片的质量控制和评价体系并不完善，仅广东省建立了《广东省中药破壁饮片质量标准研究规范(试行)》，这对于破壁饮片的发展和应用是远远不足的。本研究从性状、显微鉴别、薄层色谱、指纹图谱、粒径分布、浸出物以及指标成分的含量测定等多方面开展三七破壁饮片的质量分析，为有效制定三七破壁饮片质量标准提供实验依据。