新藤黄酸对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

鲍金平，陈贺骏涛，侯 梅，程 卉，苏婧婧，李庆林

(1.安徽中医药大学科研实验中心，安徽 合肥 230038；2.省部共建新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038)

在当今社会，肿瘤已经成为威胁人体健康和生命的严重疾病之一，肿瘤在全球的发病率和病死率持续上升[1-3]。细胞发生转移是肿瘤的特点，而肿瘤血管生成是肿瘤生长转移的关键步骤。有报道称肿瘤细胞本身能够产生血管生成因子，诱导新生血管的生成，肿瘤不仅可以在原发部位浸润生长，甚至从已存在的血管床中产生出新生血管系统，通过血管、淋巴管等途径扩散至身体其他部位[4-5]。因此将血管生成作为靶点，已经成为肿瘤防治的一个重要方向[6-7]。藤黄为藤黄科植物藤黄树(GarciniahanbaryiHook. f.)分泌的一种具有攻毒蚀疮、破血散结等功效的干燥树脂[8]，在临床上主要用于治疗顽癣恶疮、出血、损伤等，近年来发现其具有明显的抗肿瘤活性。1984年吕归宝等[9]首次从中药藤黄中分离得到新藤黄酸(gambogenic acid，GNA)，并且实验表明GNA具有抗癌谱广、毒性较低的特点。本研究通过体外实验，探讨了GNA对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)生长的抑制作用及其机制。

1 材料与仪器

1.1 试剂及细胞株 HUVECs：购于中国科学院上海细胞库；GNA：从中药藤黄中提取分离所得，纯度大于99%，由安徽中医药大学GNA课题组提供；DMEM：HyClone公司；胰蛋白酶-EDTA消化液：Amersco公司；无支原体胎牛血清：上海恒远生物科技有限公司；PBS：北京中杉生物技术有限公司；DMSO：Sigma公司；MTT：Amersco公司；DAPI：碧云天生物公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI双染试剂盒：南京凯基生物科技发展有限公司；Caspase-3抗体：CST公司。

1.2 仪器 多功能酶标仪：美国MD公司；倒置荧光显微镜：Olympus 公司；二氧化碳培养箱：日本Sanyo公司；高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；洁净工作台：苏净集团安泰公司；电子精密天平：奥多利斯科学仪器有限公司。

2 方法

2.1 药液的配制 精密称取GNA 2 mg，加入二甲基亚砜50 μL，振荡混匀，再吸入1 mL无血清培养基，从中取出21 μL至含有完全培养基的离心管中，继续加培养基至8 mL，配成浓度为8 μmol/L的GNA药液，4 ℃避光储存备用，使用时用DMEM培养基调整所需溶液浓度。

2.2 细胞培养与传代 复苏HUVECs，接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育，每天观察1次，待细胞状态良好且长至一定程度需要传代时，将细胞从培养箱中取出，弃去旧培养基，用PBS冲洗2次，吸入大约2 mL胰蛋白酶消化，显微镜下观察到细胞固缩变圆后立即加入新鲜培养基终止消化，转移细胞至离心管中，1 400 r/min离心5 min，结束后弃上层培养基，加入新鲜培养基，吹打细胞至分散，置于新的培养瓶中，隔日换液，待细胞生长稳定后，供检测使用。

2.3 MTT法测定GNA对HUVECs生长的抑制试验 取处于对数生长期的HUVECs，采取常规方法消化收集细胞，制成5×104/mL单细胞悬液接种于96孔板中，继续培养24 h，加入GNA使其终浓度为0.5、1、2、4、8 μmol/L，同时设空白对照组，每组6个平行孔，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24、48 h后，离心后弃上清液，加入MTT继续培养4 h，离心，弃上清液后加入DMSO低速振荡10 min，应用酶标仪于490 nm处测光密度(optical density，OD)值，并计算细胞存活率。存活率=(实验组OD值-空白对照组OD值)/(正常组OD值-空白对照OD值)×100%。

2.4 倒置显微镜下观察细胞形态 取处在对数生长期HUVECs，采用胰蛋白酶消化法收集细胞，细胞计数使浓度为5×104/mL，接种于含有新培养基的培养瓶中，放回培养箱中继续培养24 h后，换成含不同浓度GNA药液的培养基继续培养24 h，在显微镜下观察细胞形态并拍照。

2.5 DAPI荧光染色 取HUVECs经胰酶消化收集，用含10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为6×104/mL，每孔1 mL细胞悬液接种于6孔板中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。向各孔中加入不同浓度的GNA药液，平行设空白对照组，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。各孔中加入PBS冲洗，1 mL的4%多聚甲醛固定0.5 h，弃去固定液，PBS冲洗，加入DAPI染液，常温下避光15 min，PBS冲洗2次，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

2.6 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染检测细胞凋亡率 取对数生长期的HUVECs接种于6孔培养板，培养过夜，次日弃去上清液，换成含不同浓度GNA的培养液，继续培养24 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化后收集细胞，用PBS洗涤2次，1 400 r/min离心5 min，加入400 μL结合缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为1×106/mL。加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL的PI染液混匀。室温下避光孵育15 min，1 h内流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。

2.7 Western blot检测Caspase-3蛋白表达 不同剂量GNA溶液处理24 h的HUVECs，消化收集后提取总蛋白，蛋白上样量为20 μg，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转膜、孵育抗体、曝光后，以β-actin为参照物，对蛋白条带进行灰度值分析。

3 结果

3.1 GNA对HUVECs的增殖抑制作用 GNA 0.5、1、2、4、8 μmol/L均能有效抑制HUVECs的增殖(P<0.05)，且随着GNA浓度的增加，其作用也逐渐增强，呈明显的浓度和时间依赖性。通过公式计算得出GNA作用HUVECs 24、48 h的IC50分别为1.94、1.37 μmol/L。见图1。

注：A.空白对照组；B、C、D、E、F分别为0.5、1、2、4、8 μmol/L GNA处理组；与空白对照组比较，*P<0.05

图1MTT法检测GNA对HUVECs存活率的影响(n=6)

3.2 GNA对HUVECs生长的影响 未加药组HUVECs(A)较为饱满，细胞折光性强，贴壁状态良好，以簇状生长为主；培养24 h后HUVECs(B)在GNA药液培养基作用下，细胞数目明显减少，出现不同程度的皱缩、变小、变圆，胞质可见大小不等空泡的现象。见图2。

图2倒置显微镜下观察GNA对HUVECs生长的影响(10×20倍)

3.3 GNA对HUVECs凋亡的影响 倒置荧光显微镜下空白对照组细胞呈现弥散均匀的微弱蓝色荧光，而含GNA药液组细胞核出现致密浓染的情况，表现出显著的凋亡特征，且其作用呈浓度依赖性。见图3。

3.4 GNA对HUVECs凋亡率的影响 与空白对照组比较，GNA能诱导HUVECs凋亡(P<0.05)，且其作用随GNA浓度的增加而增加，呈浓度依赖性。见图4。

注：A.空白对照组；B、C、D分别为1、2、4 μmol/L GNA处理组

图3 DAPI单染观察不同浓度GNA对HUVECs凋亡的影响(DAPI染色，10×20倍)

注：A.空白对照组；B、C、D分别为1、2、4 μmol/L GNA处理组

图4流式细胞术检测不同浓度GNA对HUVECs凋亡率的影响(n=3)

3.5 GNA对HUVECs中Caspase-3蛋白表达水平的影响 与空白对照组比较，GNA各剂量组作用HUVECs 24 h后Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，且其作用呈浓度依赖性。见图5。

4 讨论

藤黄作为一味常见的中药，在中国有着悠久的应用历史。近数十年来，国内外众多学者对藤黄进行了大量且深入的研究，藤黄及其主要活性成分藤黄酸的药理作用广泛，其中就包括了抗肿瘤、抗炎、抗菌等作用。因其在治疗肿瘤方面呈现出显著的疗效，所以成为近年来天然药物抗肿瘤研究的热点。

注：A.空白对照组；B、C、D分别为1、2、4 μmol/L GNA处理组；与空白对照组比较，*P<0.05

血管新生是指从已存在的血管床中通过血管内皮细胞增殖、芽生、迁移等过程形成新的毛细血管网，使其功能与局部的需要相适应的生物学过程[10]。有研究表明，肿瘤血管生成诱导肿瘤生长、侵袭和转移，对肿瘤发展至关重要，以肿瘤血管生成为靶点的抗血管生成治疗作为肿瘤治疗新视野，已发展为重要的抗肿瘤策略[11-12]。已有的研究发现，中药对肿瘤血管新生有明显抑制作用，有效减缓了肿瘤的生长和恶化速度，提高患者的生活质量，已成为目前抗肿瘤研究的重要方向[13]。例如姜黄素显著增加内皮抑素的表达，明显抑制Lewis肺癌小鼠模型血管内皮生长因子的表达，从而抑制肺肿瘤的生长[14]；其抑制宫颈癌皮下移植瘤模型的基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9的表达，进而抑制肿瘤的发生发展[15]。

细胞凋亡是机体控制细胞过度增殖的一种细胞功能，其在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。肿瘤细胞是永生性细胞，而肿瘤的发生不仅与细胞增殖的异常相关，也与细胞异常的凋亡有关[16]。DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，不能通过活细胞膜，但却能穿透扰乱的细胞膜而对核染色，经药物损伤后的细胞，细胞膜破损，DAPI染料易于通过细胞膜与核内的双链DNA结合，产生荧光。本实验结果显示，GNA作用于HUVECs后出现大量的凋亡细胞，且凋亡细胞的比例明显高于空白对照组，表明GNA对HUVECs有明显的抑制作用，其作用机制可能是通过诱导细胞实现的。