W/O型黄芩苷纳米乳的制备及质量评价

郑转弟，周 安，2，吴鸿飞

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学科研实验中心，安徽 合肥 230038)

黄芩苷是从唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根中提取分离出来的一种黄酮类化合物[1-2]，具有抑制乙型肝炎病毒复制、清除乙型肝炎病毒复制模板环状DNA、抑制肝纤维化等药理作用[3-4]，临床上主要用于治疗慢性乙型肝炎。研究表明，乙型肝炎病毒易藏匿于淋巴系统[5-6]，而黄芩苷常规剂型难经淋巴转运，不能有效地富集于淋巴系统，导致慢性乙型肝炎的治疗受到一定的阻碍。纳米乳是一种新型淋巴靶向递药系统[7]，本课题组前期成功制备出W/O型黄芩苷纳米乳，相对于黄芩苷混悬剂，所制备得到的W/O型黄芩苷纳米乳可经淋巴转运，极大提高了黄芩苷的生物利用度。为进一步评价W/O型黄芩苷纳米乳的质量体系，本研究建立了W/O型黄芩苷纳米乳的高效液相色谱分析方法，对W/O型黄芩苷纳米乳中黄芩苷进行含量测定，为该制剂质量控制提供一定的参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(包含G1311X四元梯度泵、G1329自动进样器、G1316A柱温箱、G1315C紫外检测器)：美国安捷伦公司；Welch Topsil HPLC C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)：上海月旭材料科技公司；CP225D型十万分之一电子天平：德国Sartorius公司；KQ-5200B型数控超声波清洗器：江苏省昆山市超声仪器有限公司；DF-101B型磁力搅拌器：河南省巩义市予华仪器责任公司；Malvern Zeta sizer Nano ZS-90纳米粒径电位分析仪：英国马尔文仪器有限公司；SYZ-C型石英自动亚沸高纯水蒸馏器：南京桑力电子设备厂。

1.2 试药 W/O型黄芩苷纳米乳及空白纳米乳(批号分别为20171010、20171101、20171102、20171103、20171104、20171105、20171106、20171107、20171108、20171109)：自制；黄芩苷对照品(批号 110715-201318，含量≥98%)：中国食品药品检定研究院；黄芩苷原料药(批号 141201，含量为85.94%)：四川省玉鑫药业公司；大豆磷脂：安徽省合肥沃森生物科技公司；1，2-丙二醇、肉豆蔻酸异丙酯、磷酸、甲醇(色谱纯)：国药集团化学试剂公司；苏丹红、亚甲蓝：天津市光复精细化工公司；蒸馏水：自制；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 W/O型黄芩苷纳米乳的制备及载药量考察 精密称取大豆磷脂10.5 g、1，2-丙二醇10.5 g、肉豆蔻酸异丙酯9 g混合置于锥形瓶中，在45 ℃恒温下磁力搅拌至全溶，精密称定黄芩苷原料药313.5 mg溶于上述体系中，直至黄芩苷原料药全部溶解在混合溶液中，室温下往体系缓慢滴加3 g双蒸水直至体系变为透明均匀的液体，即得W/O型黄芩苷纳米乳，载药量为9.5 mg/mL。

2.2 W/O型黄芩苷纳米乳质量评价

2.2.1 外观性状 制备的W/O型黄芩苷纳米乳外观上均为橙黄色均一透明液体，流动性良好。

2.2.2 类型鉴别 采用染色法来判断纳米乳类型，取黄芩苷纳米乳(批号 20171010)5.0 mL于两只试管中，分别加入适量的水溶性染料亚甲基蓝和油溶性染料苏丹红于试管中，比较两种染料的扩散速度。结果苏丹红的扩散速度明显快于亚甲基蓝的扩散速度，表明制备的纳米乳为W/O型纳米乳。

2.2.3 粒径分布 取W/O型黄芩苷纳米乳(批号20171010)1.0 mL，用外相肉豆蔻酸异丙酯稀释至10 mL。取稀释后的纳米乳适量，用Malvern Zeta sizer Nano ZS-90纳米粒径电位分析仪测定纳米乳体系的粒径，结果见图1。本实验制备的W/O型黄芩苷纳米乳的平均粒径为(63.40±1.10)nm(n=3)，PDI为(0.166±0.006)(n=3)，表明制备的W/O型黄芩苷纳米乳大小均一，且分布均匀。

图1 W/O型黄芩苷纳米乳粒径分布图

2.3 W/O型黄芩苷纳米乳的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Welch Topsil HPLCC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸水(55∶45)；柱温为30 ℃；流速1.0 mL/min；检测波长为280 nm；进样量：10 μL。理论塔板数按黄芩苷计算，应不小于3 000。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品6.2 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得620.00 μg/mL的对照品储备液，4 ℃条件下避光储存。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密量取纳米乳1.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，超声20 min破乳。精密量取1.0 mL破乳液，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，即得纳米乳待测样品，避光保存。

2.3.4 方法学考察

(1)专属性考察 分别取空白溶剂(甲醇)、黄芩苷对照品(以甲醇稀释所得的溶液)、空白纳米乳(批号 20171101，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液)、W/O型黄芩苷纳米乳(批号 20171102，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液)，按“2.3.1”项下方法进行检测，记录色谱图，结果见图2。黄芩苷保留时间为9.59 min，辅料与试剂不干扰药物测定，表明方法专属性良好。

图2甲醇(A)、空白纳米乳(B)、黄芩苷对照品(C)、W/O型黄芩苷纳米乳(D)的高效液相色谱图(1.黄芩苷)

(2)线性关系 取对照品储备液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为12.40、31.00、62.00、124.00、186.00、248.00、310.00 μg/mL的系列溶液。按“2.3.1”项下方法进行检测，平行测定3次，求得峰面积的平均值，以黄芩苷浓度(x)与峰面积(y)作图，绘制标准曲线，并计算得回归方程y=38.125x-32.384(r=0.999 7)。结果表明，黄芩苷在12.40～310.00 μg/mL范围内与峰面积的线性关系良好。

(3)精密度试验 取标准曲线中浓度为62.00 μg/mL对照品溶液，按“2.3.1”项的色谱条件连续进样6次，记录色谱峰面积，计算RSD为0.89%，表明仪器精密度良好。

(4)重复性试验 精密量取W/O型黄芩苷纳米乳1.0 mL(批号 20171102)，共6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下的色谱条件测定，记录色谱峰面积，按“2.3.4”项下“(2)”之标准曲线计算黄芩苷含量，计算RSD为1.54%，表明方法重复性良好。

(5)稳定性考察 取同一供试品溶液分别于室温放置0、2、4、6、8、12、24 h后，按照“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰面积，按“2.3.4”项下“(2)”之标准曲线计算黄芩苷含量，计算RSD为1.21%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

(6)加样回收率试验 精密量取已知含量的W/O型黄芩苷纳米乳1.0 mL(批号 20171102)，共9份，置于100 mL容量瓶中，分别精密加入9.5 mg/mL黄芩苷对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，各3份，加入一定容积的甲醇，超声20 min破乳，最后稀释至刻度，制得低、中、高质量浓度的黄芩苷供试品溶液，按“2.3.1”项下的色谱条件测定，记录色谱峰面积，按“2.3.4”项下“(2)”之标准曲线计算黄芩苷含量，结果见表1。低、中、高3个浓度的平均加样回收率分别为98.70%、99.01%、100.31%，RSD分别为0.40%、0.66%、0.87%，表明该方法准确度良好。

表1 加样回收率试验

2.3.5 样品含量测定 精密量取6批W/O型黄芩苷纳米乳各1.0 mL，每批3份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.3.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积，按“2.3.4”项下“(2)”之标准曲线计算黄芩苷含量，结果见表2。

表2 黄芩苷含量测定结果(n=3)

2.4 初步稳定性考察 精密量取2.0 mL W/O型黄芩苷纳米乳封于安瓿瓶中(批号 20171103)，共8份，每组4份，分别进行常温实验(25 ℃放置30 d)和低温实验(4 ℃放置30 d)，分别于0、10、20、30 d时观察纳米乳的外观形状，并测定黄芩苷含量。结果见表3。在常温25 ℃、低温4 ℃条件下放置30 d，纳米乳外观澄清透明、无分层现象，且含量与0 d测定结果相比较无明显变化，表明制备的W/O型黄芩苷纳米乳在此时间内性质稳定。

表3 稳定性试验结果

3 讨论

纳米乳是一种热力学稳定体系[8]，其破乳影响药物的释放，选择适宜的破乳方法对准确检测出黄芩苷含量具有重要意义。纳米乳的破乳方法主要有化学破乳法和物理破乳法[9]。预实验中，考察了超声破乳和甲醇、乙腈的破乳效果，结果发现，超声无法破乳，乙腈破乳后出现浑浊，故选用甲醇作为破乳剂。同时，本实验考察甲醇联合超声法对所制备的W/O型黄芩苷纳米乳的破乳效果，结果发现甲醇联合超声条件下破乳效果最好(溶液澄明)。

文献报道黄芩苷含量测定时流动相的体系主要为甲醇-0.2%磷酸水[10-11]，考虑到磷酸对色谱柱的损害，本实验比较了甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液的色谱行为，结果发现两者流动相条件下峰形无差异。因此，选择甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相条件，减小对色谱柱的损伤。

本实验对W/O型黄芩苷纳米乳中黄芩苷进行含量测定，以甲醇-0.1%磷酸水为流动相，色谱峰分离效果好，峰形尖锐，操作简便，结果准确可靠，重现性好，可用于W/O型黄芩苷纳米乳的质量控制和稳定性考察。