复合酶法辅助提取漆树籽粕多糖及抗氧化作用研究

姜洪芳，石宝俊，束成杰，张锋伦，张卫明

(南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京211111)

漆树(RhussuccedaneaL.)是漆树科(Anacarkiaceace)漆树属(Toxicodendron)的落叶乔木或灌木，是我国的一种重要经济树种，主要分布在贵州、四川、云南、湖北、陕西等地，距今已有2 000余年的栽培历史。漆籽是漆树的果实，年产量约为200万吨，由糖类、纤维、粗蛋白、脂肪、水分和灰分等组成，油脂含量较高，可以从漆籽皮和漆籽仁中分别提取得到漆蜡和漆籽油。漆蜡中含有三甘油酯、游离脂肪酸和游离脂肪醇，品质较高，价格低廉，可以代替棕榈蜡和芳香蜡用于高档化妆品行业[1]。漆油富含不饱和脂肪酸，其中亚油酸含量在60%以上，亚油酸具有调整血脂和抗动脉硬化作用，能减少冠心病的发病率和死亡率，具有很高的保健功能[2]。作为重要的化工原料漆籽油还可用于制备生物柴油。漆籽的资源利用已引起各界的高度重视，漆籽加工漆蜡(油)后，剩余部分的漆籽饼粕年产量约为100万吨，含有36%糖类，30%粗纤维，20%粗蛋白，5%脂肪，其中的多糖类物质进一步提取、分离精制可以作为日用化学品、食品等原料，以期提高漆籽资源的综合效益及增加漆树籽粕的经济价值。

多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质。广泛存在于植物、动物和微生物中。越来越多的研究发现，植物多糖因其充足资源和低毒高效的药理活性广泛应用于食品和药物领域[3-4]。目前已从植物中分离得到数百种多糖，大量的药理实验表明，多糖具有调节免疫、抑菌、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、调节胃肠功能、降低胆固醇，帮助身体组织结构再生和修复，促进伤口愈合等作用[5-7]。

多糖的提取方法有水提法、碱提法和酶提法等，其中酶提法是利用酶对细胞结构的破坏作用，使存在于细胞内部的多糖释放出来，从而提高了多糖的得率。本实验采用纤维素酶和木瓜蛋白酶辅助法对漆树籽粕进行酶解后，结合陈虹霞等回流提取工艺[8]，研究了漆树籽粕多糖的酶解最佳条件及对羟自由基和DPPH的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

漆树籽2017年10采集于陕西安康平利，自然晾干、粉碎成粉末，备用；纤维素酶(酶活性15 U/mg) (上海耕奔生物技术有限公司)；木瓜蛋白酶(酶活性80万U/g) (广西庞博生物工程有限公司)；石油醚、乙醇、丙酮、乙醚、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、DPPH、过硫酸钾、甲醇、抗坏血酸购自国药集团化学试剂有限公司；蒸馏水自制。

T6-新世纪紫外可见分光光度仪(北京普析通用仪器有限责任公司)；PHS-3TC精密数显酸度计(上海天达仪器仪器有限公司)。离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；HH-4恒温水浴锅(上海江星仪器有限公司)；FD-1冷冻干燥仪(北京博医康实验仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

精确称取葡萄糖标准品10 mg，加入蒸馏水溶解并定容到50 mL，得到0.2 mg/mL的标准品标准溶液。分别移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.9 mL的1 mg/mL标准溶液至10 mL的试管中，补加蒸馏水至终体积为1.0 mL，分别加入1.0 mL 5%的苯酚，摇匀后，加入3.5 mL的浓硫酸，迅速振荡摇匀，室温下静置25 min，在490 nm处测吸光度。绘制吸光度与浓度的标准曲线，并拟合线性回归方程。回归方程Y=9.508 1X-0.013 9，相关系数R=0.999 3。葡萄糖在28～193 μg区间具有良好的线性关系。

1.2.2 热回流浸提漆树籽粕多糖

漆籽粉末，加入料液比1∶10(g∶mL)的石油醚在70 ℃下，提取4次，每次3 h，过滤，滤液合并，真空浓缩为漆蜡。滤渣干燥，即为漆树籽粕。取漆树籽粕10 g，放入500 mL烧瓶中，按20∶1的料液比加入蒸馏水，在50 ℃ 水中浸泡1 h，升温至90 ℃提取0.5 h，冷却至适宜温度，加入适量酶溶液，酶解提取1 h。然后升温至90℃提取1h过滤，得到滤液。在旋转蒸发仪上60 ℃真空浓缩至50 mL，加入无水乙醇，与多糖水溶液的体积比约为25∶1，在4 ℃下静置24 h，离心(4 000 r/min)得到沉淀，再用乙醚、丙酮(体积比约为10∶1)洗多糖沉淀两次，最后将沉淀冷冻干燥得到各多糖提取物。按照1.2.1的方法在490 nm下测定吸光度。漆树籽粕多糖得率(%)=(多糖的质量/原料的质量)×100。

1.2.3 木瓜蛋白酶、纤维素酶单因素试验

漆树籽粕细胞壁、膜由多糖和蛋白质组成， 采用木瓜蛋白酶和纤维素酶能够水解蛋白和纤维素， 破坏细胞壁、膜结构，使多糖易于从细胞内释放出来。

1.2.3.1 木瓜蛋白酶单因素试验

90 ℃热水提取0.5 h后，适当冷却，加入适量木瓜蛋白酶溶液，考察酶用量(为漆树籽粕粉重量的0.1%、0.2%、0.5%、1% 、1.5%、2%)，酶解温度(40、45、50、55、60 ℃)，酶解反应pH值(4、5、6、7、8)，酶解反应时间(0.5、1、2、3、4 h)对漆树籽粕粗多糖得率的影响。

1.2.3.2 纤维素酶单因素试验

90 ℃热水提取0.5 h后，适当冷却，加入适量纤维素酶溶液，酶解提取1h为固定条件，考察酶用量(为漆树籽粕粉重量的0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%)，酶解温度(35、40、45、50、55 ℃)，酶解反应pH值(3.5、4、4.5、5、5.5、6)，酶解反应时间(0.5、1、2、3、4 h)对漆树籽粕粗多糖得率的影响。

1.2.4 漆树籽粕多糖对羟自由基清除能力的测定

将漆树籽粕多糖提取物用蒸馏水配制成0.05～50 mg/mL的浓度梯度，以Vc作为对照组进行实验。取1 mL样品溶液，加入1 mL浓度为10 mmol/L的FeSO4溶液，混合均匀后加入2 mL浓度为2.5 mmol/L的过氧化氢和1 mL浓度为10 mmol/L的水杨酸乙醇溶液，于37 ℃水浴中反应30 min，于510 nm处测其吸光度，空白对照对蒸馏水代替样品溶液[9]。对羟基自由基清除能力的测定按以下公式进行计算：

其中：A0为反应体系中不含样品，即以1 mL 65%乙醇代替样品的吸光度值；

A1为反应体系中含有样品的吸光度值；

A2为反应体系中含有样品,但以2.00 mL蒸馏水代替H2O2的吸光度值。

1.2.5 漆树籽粕多糖对DPPH自由基清除能力的测定

分别移取不同浓度的样品及对照品溶液2.00 mL，加入0.5 mmol/L DPPH甲醇溶液2.00 mL，混匀15 s后，放置30 min，以2 .00mL不同浓度样品或对照品溶液加入2.00 mL甲醇为参比，于517 nm测吸光度，记为A1，每个试样作三次平行测定，取其均值，同时移取2.00 mL 65%乙醇加入2.00 mL 0.5mM DPPH甲醇溶液，混匀15 s后，放置30 min，以2.00 mL 65%乙醇加入2.00mL甲醇为参比，于517 nm测吸光度，记为A0[10]，并根据下述公式计算清除率。

2 结果与讨论

2.1 木瓜蛋白酶单因素试验

2.1.1 酶用量

木瓜蛋白酶加入量分别为漆树籽粕重量的0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%，酶解温度为45 ℃ ，结果见图1。

图1显示，随着蛋白酶用量的增加，多糖得率也逐渐增加，酶用量大于1%后提取率增加趋于平缓。考虑酶的成本及提取效果，宜将蛋白酶用量确定为1%。

2.1.2 酶解温度

90 ℃热水提取0.5 h后，加入适量木瓜蛋白酶溶液，酶用量为漆树籽粕重量的1%，分别于40、45、50、55、60 ℃ 下酶解提取1 h， 结果见图2。

图1 木瓜蛋白酶用量对多糖得率的影响

图2 酶解温度对多糖得率的影响

图2显示， 酶解温度对漆树籽粕多糖的提取有显著影响。在50 ℃ 时，多糖得率最高。

2.1.3 酶解反应pH值

木瓜蛋白酶浓度为1%，将酶解反应的pH值分别控制在4、5、6、7、8，在50 ℃ 下酶解反应1 h，结果见图3。

图3 木瓜蛋白酶反应pH值对多糖得率的影响

图3显示，酶反应的pH值对香菇多糖的提取有很大影响，pH值在6～7之间时多糖的提取率最高。考虑生产实际，可选用自然条件下的pH值。

2.1.4 酶解反应时间

控制木瓜蛋白酶用量为1%， 自然pH值(约6.5)，在50 ℃下分别反应0.5、1、2、3、4 h，结果见图4。

图4 木瓜蛋白酶反应时间对多糖得率的影响

图4显示，随着酶解时间的延长，多糖得率也随之增加，当酶解时间超过1 h后，得率的增幅趋于平缓。考虑实际生产情况，酶解作用1 h较为适宜。

2.2 纤维素酶单因素试验

2.2.1 酶用量

控制纤维素酶浓度分别为漆树籽粕重量的0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%，酶解温度为40 ℃ ，结果见图5。

图5 纤维素酶用量对多糖得率的影响

图5显示，随着纤维素酶用量的增加，漆树籽粕多糖得率也随之增加，酶浓度超过0.5% 后得率的增幅很小。因此，纤维素酶浓度确定为0.5%比较适宜。

2.2.2 酶解温度

90 ℃热水提取0.5 h后，加入适量纤维素酶溶液，使酶浓度为漆树籽粕重量的0.5%，分别于35、40、45、50、55 ℃ 下酶解提取1 h，结果见图6。

图6显示，酶反应温度在45 ℃时多糖得率最高。但在35～55 ℃ 范围内，提取结果无显著差异， 因此实际生产中也可根据需要选择温度。

2.2.3 酶解反应pH值

纤维素酶浓度为0.5%，将酶解反应的pH值分别控制在3.5、4、4.5、5、5.5、6，在45 ℃下酶解反应1 h， 结果见图7。

图6 纤维素酶反应温度对多糖得率的影响

图7 纤维素酶反应pH值对多糖得率的影响

图7显示，pH值对酶解提取效果有很大影响，pH值在4.5～5.0之间时，多糖得率最高。

2.2.4 酶解反应时间

控制纤维素酶浓度为0.5%，pH值为5.0，在45 ℃下分别反应0.5、1、2、3、4 h， 结果见图8。

图8 纤维素酶反应时间对多糖得率的影响

图8显示，随着酶解时问的延长，多糖提取率逐渐增加。当酶解时间超过1h时，多糖得率增幅较小，因此酶解时间可确定为1 h。

2.3 漆树籽粕多糖的抗氧化作用

2.3.1 漆树籽粕多糖对羟基自由基的清除能力

活性物质的抗氧化作用归因于各种反应机制，如清除自由基、还原能力，阻止连锁启动及螯合催化反应过程中所需的金属离子等。羟自由基被认为是氧化应激损伤主要原因，其很容易穿过细胞膜，与碳水化合物、蛋白质和DNA等大多数生物大分子反应[11]。不同浓度的VC和漆树籽粕多糖提取物对羟基自由基的清除能力如图9所示。漆树籽粕多糖提取物对羟基自由基具有较强的清除能力，10 mg/mL 的漆树籽粕多糖和Vc 对羟自由基清除率分别为62.6% 和92.5%，漆树籽粕多糖提取物对羟自由基的IC50值为8.16 mg/mL。说明漆树籽粕多糖能够有效清除或阻止羟自由基反应，将羟自由基转化为无毒的物质[12]。

图9 漆树籽粕多糖对羟自由基的清除能力

2.3.2 漆树籽粕多糖对DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，其溶液具有特征的紫红色团吸收峰，当其单电子在517 nm附近有强吸收(显深紫色)。当有机清除剂存在时，单电子被配对，吸收消失或减弱，其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系，因而可用分光光度法进行定量分析。利用该方法研究漆树籽粕多糖提取物的抗氧化能力。由图10可知，对DPPH自由基的清除率与漆树籽粕多糖的浓度呈正相关，当浓度从0.05 mg/mL增加至10 mg/mL时，清除率随着浓度的增大显著增强。当浓度在10 mg/mL时，清除率为56.86%，清除效果低于VC，其IC50值为6.83 mg/mL。以上数据可以说明漆树籽粕多糖具有较强的抗氧化活性。

图10 漆树籽粕多糖对DPPH自由基的清除能力

3 结 论

在漆树籽粕提取中加入木瓜蛋白酶和纤维素酶进行辅助提取，能够显著提高多糖得率。纤维素酶的最佳酶解条件是：酶浓度是漆树籽粕粉重量的0.5%，酶解温度45 ℃ ，pH值4.5～5.0，酶解反应1 h。木瓜蛋白酶的最佳酶解条件是：酶用量是漆树籽粕粉重量的1%，酶解温度50 ℃，pH值6～7， 酶解反应1 h。在此条件下漆树籽粕多糖得率为2.371%，与不加酶的漆树籽粕多糖空白相比，多糖得率增加23.87%。研究漆树籽粕多糖对羟自由基和DPPH自由基的清除能力，并与VC进行对比，结果表明漆树籽粕多糖具有一定的抗氧化活性,其清除能力低于VC。当浓度为10 mg/mL时，对羟自由基的清除率为62.6%，IC50为8.16 mg/mL。当浓度为10 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为56.86%，IC50值为6.83 mg/mL。