青花椒水提物及精油对松材线虫的防治探究

束成杰，张孟丽，赵孔发，张锋伦，张卫明*

(1. 南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京211111；2. 南京师范大学 生命科学学院，江苏 南京210023；3. 昭通市大成农业开发有限责任公司, 云南 昭通657100)

松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)，常见的松树寄生虫，属于线形动物门，滑刃目(Aphelenchida)、滑刃科(Aphelenchoididae)、伞滑刃属(Bursaphelenchus)动物[1]。松材线虫病又名松材线虫萎蔫病、松树萎蔫病、松树枯萎病，是一种松树毁灭性病害，具有危害性大、传播速度快、防治难度大等特点，是世界性检疫对象。松材线虫的生活史如图1所示，包括2个周期，分别是繁殖周期和扩散周期，繁殖周期和扩散周期同样需经历卵、一龄幼虫、二龄幼虫、三龄幼虫、四龄幼虫(即 L1，L2，L3，L4)和成虫六个虫态。在25 ℃左右的条件下，松材线虫4～5 d即可繁殖一代[2-3]。与繁殖周期不同的是，扩散型幼虫以L3虫态在寄主松树内休眠越冬，第二年春天，扩散型 L3 幼虫脱皮成长为扩散型 L4，L4 为持久型幼虫，通过媒介传播侵染健康松树来补充营养，成长为成虫进而繁殖。

图1 松材线虫生活史[2]

近几十年来，围绕植物源物质防治植物病原线虫开展了广泛研究，杀线虫剂的开发应用正从原来的高毒、高残留向低毒、高效、低残留的绿色环保农药方向发展。早期实验使用棉球实验法测定了31科61种陆地植物对松材线虫的毒杀活性[4]。实验对骆驼篷等15科28种植物提取物对线虫的控制作用研究表明：骆驼篷、黄文江鱼藤、桃花心木的提取物均对线虫有很强的触杀活性，而且也能明显的增加植株地上部高度、重量和根长。白花曼陀罗叶提取物和三尖杉有同样的抑制线虫发育现象[5, 6]。

青花椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb. et Zucc.)为芸香科花椒属植物，含有丰富的挥发油、生物碱、酰胺类化合物等成分，主要生物活性具有抗菌、镇痛、抗癌、抗病毒、保护心血管、提高机体免疫力等作用，在食品、医药、农业和日化行业中具有巨大的应用潜力[7, 8]。本文探究青花椒水提物及精油对松材线虫的防治作用，为生态环保型农药开发提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料

松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，由江苏省农业科学院提供；特级青花椒，采购于云南省昭通市鲁甸青花椒种植基地。

1.2 仪器与设备

电子分析天平(上海越平科学仪器有限公司)；高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；旋转蒸发仪(上海亚荣仪器厂)；ZNHW-II型智能恒温电热套(巩义市予华仪器有限责任公司)；数显恒温水浴锅(常州天瑞仪器有限公司)；所有试剂均采购于国药集团化学试剂有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 青花椒水提物制备方法

取干燥青花椒果皮100 g，粉碎后过40目筛，按料液比1:10加入蒸馏水加热煮沸，水提3 h，过滤除杂，再经减压浓缩、干燥，得水提物浸膏，蒸馏水稀释，过0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，青花椒水提物母液浓度为40 mg/mL，4 ℃冰箱贮存，备用[9]。

1.3.2 青花椒精油制备方法

取干燥青花椒果皮100 g，粉碎后过40目筛，置于蒸馏瓶中，按料液比1:10加入蒸馏水浸泡12 小时，水蒸气蒸馏4 小时，收集精油部分，加等体积的乙醚萃取3次，蒸发乙醚，干燥器干燥，得透明油状物即为青花椒精油[10, 11]。

1.3.3 松材线虫培养方法

文献已总结报道了松材线虫的培养方法。根据松材线虫生活史，采用 PDA 平板培养灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，待其铺满平板后接种松材线虫，25 ℃恒温培养4～5天，用无菌水冲洗PDA平板，可获得四龄幼虫(L4)/成虫。用蒸馏水收集线虫并制备线虫悬浮液(约100条/100 μL水溶液)。PDA 培养基制备及真菌培养按常规方法进行[12-14]。

1.3.4 青花椒水提物杀虫浓度探究

取青花椒母液，用无菌蒸馏水稀释成20 mg/mL备用，96孔板中两倍梯度稀释，每孔再分别加入100 μL四龄幼虫(L4)/成虫悬浮液，最终浓度为2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 0.156, 0.078, 0.039, 0.019 mg/mL，设三个平行，分别在4小时和24小时观察一次，实验重复三次[15]。

1.3.5 青花椒精油杀虫浓度探究

取青花椒精油，用二甲亚砜(DMSO)溶解，再用无菌蒸馏水进行稀释，96孔板中分别加入100μL不同浓度的青花椒精油，再各加入100 μL四龄幼虫(L4)/成虫悬浮液，1% DMSO溶液为空白对照。青花椒精油浓度梯度(v/v)为0.8%, 0.4%, 0.2%, 0.1%, 0.05%,0.025%, 0.012%, 0.006%(二甲亚砜工作浓度低于1%)，设三个平行，分别在4小时和24小时观察一次，记录L4/成虫的死亡率。松材线虫死亡判断标准：当在立体显微镜下用铂金丝对线虫进行物理刺激后，身体仍然保持静止不动的线虫即判定为死亡，实验重复三次[16-17]。

1.3.6 青花椒水提物对松材线虫运动能力的影响

松材线虫在液体中围绕身体的中点的有规律的弯曲，被称为“摆动”[18]。在96孔板中，将L4/成虫用青花椒水提物的梯度浓度处理4小时和 24小时。通过倒置显微镜目测观察和手持式计数器计数，确定 1 min内的线虫头部的摆动次数，每组数量不低于30条，设三个平行，分别在4小时和24小时观察一次，实验重复三次[6]。

1.3.7 青花椒精油对松材线虫运动能力的影响

在96孔板中，将 L4/成虫用青花椒精油的梯度浓度处理4小时和 24小时，同时设置1% DMSO溶液为对照。通过倒置显微镜目测观察和手持式计数器计数，确定 1 min内的线虫头部的摆动次数，每组数量不低于30条，设三个平行，分别在4小时和24小时观察一次，实验重复三次。

1.3.8 统计学分析

图用Microsoft Excel 2017软件绘制(Microsoft Corp., Redmond, WA)。数据分析使用SPSS 12.0软件完成(SPSS Inc., Chicage, USA)。不同的组别之间使用方差分析(ANOVA)。概率水平0.01代表统计分析上的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 青花椒水提物对松材线虫的防治效果

按照上述实验方法，将松材线虫暴露在不同浓度的青花椒水提物中。4小时和24小时分别观察一次，实验结果如图2所示。

图2 4小时和24小时青花椒水提物处理松材线虫致死率

处理4小时后，除0.019 mg/mL以外，各浓度对松材线虫均具有显著性的致死作用(**P<0.01)。浓度为0.625 mg/mL时，松材线虫死亡率为(54.33%±2.52)%；浓度为2.5 mg/mL时，松材线虫死亡率为100%。处理时间延长至24小时后，松材线虫死亡率上升，所有实验浓度对松材线虫均具有显著性地杀灭作用(**P<0.01)。当浓度为0.313 mg/mL时，松材线虫死亡率为(54.00%±2.65)%，浓度为1.25 mg/mL时，松材线虫死亡率为100%。4小时和24小时杀虫效果相比，由于时间的延长，青花椒水提物杀虫作用更加明显。然而，在实际农林生产应用中，病虫害防治需要考虑天气因素，见效快也十分必要。因此，选择处理4小时的0.625 mg/mL作为青花椒水提物防治松材线虫的LC50，绝对致死剂量(LD100)为2.5 mg/mL。

2.2 青花椒精油对松材线虫的防治效果

按照上述实验方法，将松材线虫暴露在不同浓度的青花椒精油中。4小时和24小时分别观察一次，实验结果如图3所示。处理时间为4小时，各浓度对松材线虫均具有显著性的致死作用(**P<0.01)。当青花椒精油浓度为0.025%时，松材线虫死亡率为55.67%±4.04%，浓度为0.2%和0.1% 时，松材线虫死亡率为100%。处理24小时，杀虫效果与4小时处理相比，杀虫效果没有显著性的差异。因此，选择处理4小时的0.025%作为青花椒精油防治松材线虫的LC50，绝对致死剂量(LD100)为0.1%。

图3 4小时和24小时青花椒精油处理松材线虫致死率

2.3 青花椒水提物对松材线虫运动能力的影响

运动行为反映了神经系统的活动，并且依赖于多种因素包括外部刺激、神经元结和动物内部环境的变化等。细胞或者功能水平上发生的变化可以深刻地影响线虫基本的和诱发性的运动行为。因此，行为分析可为神经元功能的检测提供简单、敏感的方法。实验分别测定了4小时和24小时松材线虫在青花椒水提物0.156、0.078、0.039、0.019 mg/mL浓度下1 min内头部摆动的次数。实验结果显示，青花椒水提物处理4小时后，除了0.019 mg/mL浓度下松材线虫头部摆动未出现显著性变化，其他处理浓度下松材线虫头部摆动频率与对照相比均出现显著性降低(**P<0.01)(图4)，线虫虫体表现出异常扭曲情况，主要是螺旋卷曲或多重卷曲，甚至僵直不动。处理时间延长至24小时，四个浓度下松材线虫头部摆动频率与对照相比均出现显著性降低(**P<0.01)。综上所述，青花椒水提物能够改变松材线虫的运动行为，从而影响松材线虫的神经功能。

图4 处理4小时和24小时青花椒水提物对松材线虫头部摆动频率的影响

2.4 青花椒精油对松材线虫运动能力的影响

实验分别测定了4小时和24小时松材线虫在青花椒精油0.025%、0.012% 和0.006% 浓度下1 min内松材线虫头部摆动的次数。实验结果显示，处理4小时和24小时后，0.025%、0.012%、0.006% 三个浓度的青花椒精油均能显著性地降低松材线虫头部摆动频率(**P<0.01)(图5)。随着处理时间的延长，24小时的处理结果也显著性低于处理4小时的结果。综上所述，青花椒精油能够改变松材线虫的运动行为，从而影响松材线虫的神经功能。

图5 处理4小时和24小时青花椒精油对松材线虫头部摆动频率的影响

3 讨 论

青花椒作为花椒属植物，广泛种植于我国山西、四川、云南等地，研究显示花椒主要有挥发油、生物碱等多种化学成分，对心血管系统、消化系统、免疫机能都有重要的作用[19-20]。松材线虫是一种世界范围内的检疫性害虫，是松树枯萎病的病原，它给木材以及木制品输出国造成巨大的经济损失[21-22]。本实验采用青花椒水提物及精油处理松材线虫，实验结果表明青花椒水提物及精油对松材线虫均具有显著的防治作用。 0.625 mg/mL青花椒水提物处理4小时，松材线虫可达到半数致死，2.5 mg/mL则为绝对致死剂量(LD100)。0.025%青花椒精油处理4小时，松材线虫可达到半数致死，0.1%则为绝对致死剂量(LD100)。

线虫运动行为反映了其神经系统的活动，对松材线虫运动行为的探究结果显示，青花椒水提物0.156、0.078、0.039 mg/mL处理4小时，其头部摆动频率均出现显著性降低。青花椒精油0.025%、0.012%、0.006%三个浓度处理4小时，均能显著性地降低松材线虫头部摆动频率，从而影响松材线虫的神经功能与活动。

已有研究表明，植物源杀线虫剂具有分解快、残留低、污染少、毒性小等特点，如α-律草烯、松脂酚、苦豆碱等，其他植物提取物如毛鱼藤根提取物、神农香菊提取物、苦楝树皮提取物等也对松材线虫具有显著性的杀灭作用[23, 24]。青花椒水提物和青花椒精油提取工艺简单，产量大，在粗提物的水平上即可用来防治松材线虫，为生态环保型农药开发提供实验参考。我国花椒属植物资源颇为丰富，对青花椒水提物及精油防治松材线虫的研究，可提高青花椒的利用价值，为青花椒开发利用带来新的特色。