药用白及资源再生策略初探

张朝阳，符雨薇, 2， 谭耀武，陈永霞，卢 艳，毛心莹，韩静茹, 5，万 娜，6，何俊梅, 2，罗玉琴, 2

(1.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550002；2.贵州医科大学，贵州 贵阳 550025；3.福建中医药大学,福建 福州 350000；4.武陵源人民医院, 湖南 张家界 427400；5.贵州中医学院，贵州 贵阳550025；6.黔南民族师范学院，贵州 都匀 558000)

白及[Bletillastriata(Thunb.) H. G. Reichenbach] 为兰科白及属植物，主产于贵州、四川、湖南、江西等省区[1]。干燥块茎是著名中药，用药历史久远。主要成分包括白及多糖、联苄类、菲类及其衍生物；此外，含少量挥发油、黏液质等[2-5]。性味苦、涩、甘，微寒，入归肺、肝、胃经；能收敛止血、消肿生肌，主治内外伤出血、痈肿疮疡、皮肤皲裂、水火烫伤等[6]。作为传统中药复方组成成分以外，白及是白及颗粒、复方白及膏、白及冲剂等多种中成药的重要原料药[7]。同时，白及在医疗、保健、美容领域的用途还在不断拓展。譬如，以白及制成的白及牙膏，可用于防治口腔溃疡、咽喉肿痛、牙周炎、牙龈炎、防龋、 口腔异味等口腔和牙科疾病[7-8]；以白及胶制成的白及纤维，可用于功能辅料、生物医用增强纺织品、缝合线和穴位埋置线等产品，具有较大的应用潜力[9]。此外，基于白及胶的粘合性能，白及还可用于高级卷烟烟条粘合剂、字画粘合剂等[6]。因此，白及具有较高的药用价值和经济价值。近年来，白及种植规模不断扩大。为了更好地推动白及资源研究和可持续利用，本文就白及种质及快繁技术研究进展作一综述，并就白及资源再生策略进行初步探讨，为相关研究和生产提供参考。

1 白及资源供需状况

白及功效多样，在医疗、保健、美容及其它工业领域的用途不断拓展，资源供求矛盾较为突出,价格逐级攀升(图1)[7]。长期以来，白及用药主要利用野生资源，资源利用强度增加导致白及资源逐步匮乏，资源匮乏制约相关产业发展并危害遗传资源安全，国家野生动植物保护已将白及列为Ⅱ级保护植物。对白及野生资源的直接利用不仅违反国家的植物保护法规而且无法标准化，从而制约相关产品的品质提升。白及人工规模化种植有望改变这一局面。

图1 2000年至2010年白及价格走势图[7]

2 白及种质资源研究进展

种质种苗是规模化种植的源头关键环节。对于中药材而言， 从野生种群中筛选优质高产自然种源是关键。龚晔等[10]基于白及地理分布信息和影响白及分布的主导气象因子，利用最大熵模型和地理信息系统预测了中国白及的潜在分布与其气候特征。结果表明：中国白及潜在分布区主要位于秦岭、淮河以南大部分地区，主要适生省份为云南、湖北、四川、湖南、江西、浙江。表明白及物种分布广，适应能力强。张萃蓉等[11]对不同产地白及进行了栽培比较试验，发现峨眉白及质优产高，明显优于参试的其他白及。徐中志等[12]对不同地理来源的28份白及种源进行了物候期、形态特征的分析与评价，结果表明：不同种源白及的生长物候期、形态特征以及经济性状因地理来源不同而存在一定的差异；出苗期变异范围为5月初-7月初；生育期变异范围为145～180d，地理种源之间差异明显；海拔越高，出苗时对温度的要求越低，在同一地点栽培时出苗时间越早，倒苗时间也相应提前；白及的叶面积与株高呈正相关，即株高越高，叶子越长，叶面积越大；从单株平均重量、抗病性等方面衡量，云南永胜种源较好。黄良永等[13]以HPLC法测定了不同产地白及药材中1，4- 二[4-(葡萄糖氧)苄基] -2- 异丁基苹果酸酯的含量，发现贵州正安白及(3.32%)是云南曲靖白及(1.45%)含量的2倍， 湖北竹溪种源 (含量4.8%～4.9%)是湖北郧县白及(含量1.1%)的4～5倍，表明该成分含量与地理分布具有明显的相关性。和志娇等[14]利用ISSR分子标记对25份白及种质进行了遗传多样性的研究，发现白及属植物ISSR分子标记位点多态性比率达到87.90%；25份参试白及种质遗传距离处于0.4483-0.7903之间，种内种间具有丰富的遗传变异。吴明开等[15]针对白及进行了SSR位点引物开发，获得了9对能稳定扩增的SSR位点引物。对微卫星标记的研究[16-17]表明：白及微卫星位点等位基因数变异范围为3-16，而杂合度变异范围较为离散。孙宇龙等[18]基于SRAP标记的白及遗传多样性研究表明：白及具有较高的遗传多样性水平, SRAP标记平均多态位点百分比(PPB)为90.48%,香农信息指数(I)为0.5096；白及居群间存在中等水平的遗传分化,遗传分化指数Gst为0.2609，遗传距离和地理距离间有显著正相关性(r=0.6329;P<0.000 1)。吴劲松等[19]研究了nrDNA ITS、LFY 同源基因内含子2、叶绿体ycf1 基因在白及属植物中的变异，发现白及属物种nrDNA ITS 和ycf1 序列的种间变异(0.022～0.106 和0.017～0.106) 明显大于种内变异(0～0.012 和0～0.015)； 基于nrDNA ITS 和ycf1 序列的NJ 树能准确地区分白及属4 个物种。 另外，Mi等[20]基于等位酶多样性数据认为白及经历了末次盛冰期向南迁徙，然后从冰期避难所回复扩散的过程。这些研究表明白及物种分布广泛，具有复杂的扩散分化历史，其种质资源因环境异质性而呈现多样化，具有丰富的产量、品质相关遗传变异，具有较大的选育种潜力。

从育种进程上看，张萃蓉等[11]发现了质优产高的峨眉白及；徐中志等[12]获得了数个适应云南当地环境条件的优良种源；吴明开等[15]从梵净山居群筛选出了优良单株；安徽振扬农林有限公司培育并命名了一个栽培品系-‘巨茎白及’，该品系产量较高，分类上被归于白及[19]。这些品种的发现为白及人工种植提供了基础的种源选择。白及遗传资源分布广，变异丰富。同时，其同属近缘种黄花白及B.ochraceaSchlechter、小白及B.formosana(Hayata) Schlechter、华白及B.sinensis(Rolfe) Schlechter在我国也有分布，这些近缘种在化学成分和生物学特性上与白及有相似亦有差异，它们相互间能否进行资源替代？是否具有某些方面的独特优势？这些问题的进一步揭示，将拓展药用白及的品种资源。有理由相信随着评价取材范围的进一步拓展，会有更多更好的自然种源出现。

3 白及繁育技术研究进展

白及为多年生草本，虽然能开花结果，但种子无胚乳，在自然状态下，极少萌发成苗。传统上，药农主要依靠块茎繁殖，效率低，成本高。建立并完善白及快繁技术体系，规模化、低成本生产白及种苗，具有较大的现实意义和价值。

以种子为外植体进行白及微繁是相对简易的一种方式。曾宋君等[21]研究了白及的无菌播种及试管苗茎尖组织培养实验。结果表明:种子在基本成熟时胚的萌发率和成苗率最高,萌发期与成苗期最短;胚萌发的最适培养基为1/2MS;在培养基中加入10 %的椰子汁能提高萌发率与成苗率,加入1%的活性炭有利于试管苗的生长;试管苗茎尖在MS培养基附加6-BA 0.5mg/L和NAA 0.2mg/L时增殖效果好;生根培养以1/2MS培养基附加NAA 0.5mg/L效果最好,加上10%的香蕉汁有利于生根壮苗。张燕等[22-23]发现培养基附加低浓度的6-BA、KT将抑制种子的萌发和生长，附加活性炭和GA3有利于根系生长发育和植株长势，腐殖土和蛭石1∶1混合作为炼苗基质，炼苗成活率可达90%以上；对白及种子原球茎发育的研究发现1/2MS、6-BA 5.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L对原球茎诱导具有较好效果。吴明开等[15]以种子无菌萌发为基础建立了白及种苗规模化生产技术体系，发现1/2MS添加NAA 0.5 mg/L可作为种子萌发最佳培养基；1/2MS添加NAA 0.2-0.5 mg/L、白糖2%、琼脂0.7%、活性炭0.1%为较佳的生根培养基；邹娜等[24]发现MS、KT1.0 mg/L、NAA0.5 mg/L对于以种子为材料诱导原球茎和芽的分化效果较好；培养基MS、6-BA 0.45 mg/L、NAA 0.4 mg/L对于壮苗生根培养有利。张洁等[25]以白及成熟蒴果为材料，以1/2 MS加5%土豆汁、5%白砂糖为发芽培养基，以1/2 MS添加6-BA 2 mg/L、NAA 0．5 mg/L、5%土豆汁、5%白砂糖为增殖壮苗培养基进行种苗扩繁，然后用蔬菜育苗基质和漂盘进行驯化栽培，获得较好效果，成活率高达95%以上，整个育苗周期为160d左右。张宇思等[26]研究了白及种子萌发和原球茎生长的液相-固相培养基培养效果,比较了全程固体培养基培养(QG)与液体固体培养基分段培养(YG)这2种培养方式的优劣。结果表明：添加剂种类、大量元素、6-BA浓度、NAA浓度对白及种子萌发及原球茎诱导影响最大，最佳培养条件为1/4MS添加1mg/L NAA、0.5 mg/L 6-BA、100 g/L马铃薯汁、30g/L蔗糖,pH值5.8,培养温度22 ℃,摇床转数100r/min,每天光照时间8 h；源于YG的白及苗在移栽成活率、叶片颜色、叶片长度、苗高几个方面均优于源于QG的白及苗,且差异显著。 此外，李伟平等[27]以白及种子为材料，在1/2MS培养液中萌发后作为包埋材料，建立了白及人工种子制作方法，为白及繁育提供了一条新途径；李晶等[28]研究了成熟黄花白及种子非共生萌发及幼苗发育条件，发现马铃薯、蔗糖、NAA、6-BA 4个因素对种子萌发率的影响不显著，但蔗糖和马铃薯对幼苗发育的影响显著，培养基含蔗糖10g/L、 马铃薯100g/L、6-BA0.5g/L时幼苗发育较好，可为白及种子微繁技术优化提供参考。

以白及根、茎尖为外植体进行丛生芽诱导增殖也获得了一定程度的探索。余朝秀等[29]发现MS添加6-BA 1.0-3.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L可诱导白及茎尖及侧芽萌生增殖芽;MS添加KT 4.0mg/L、NAA 0.2mg/L诱导增殖的效果最好,培养40d后增殖率可达450%;1/2 MS添加NAA 0.5mg/L有利于生根,且植株长势健壮； 以60%腐叶土、30%珍珠岩、10%素红土混合作为炼苗基质可获得较好炼苗效果;炼苗温度23-27℃,空气相对湿度80%-90%有利于提高炼苗成活率。雷湘等[30]发现1/2MS添加6-BA 1.0 mg/L、NAA 2.0 mg/L能很容易地从幼根诱导出丛生芽；MS添加6-BA 1.0 mg/L、NAA0.05 mg/L利于丛生芽增殖；1/2MS添加NAA 0.5 mg/L利于生根培养。

通过外植体-愈伤诱导-类原球茎形成再到植株再生是白及微繁技术体系的重要途径。针对白及愈伤和原球茎诱导增殖的研究[31]表明: 原球茎或茎尖在添加2,4-D 或NAA的Vacin and Went (VW) 培养基中培养，3-5周后即可形成绿色愈伤；以原球茎作为外植体，培养基添加2,4-D 1.0mg/L，可获得48.0%的诱导成功率；NAA和2,4-D可显著促进愈伤增殖，2,4-D 1.0mg/L和TDZ 1.0mg/L的激素组合可获得最快愈伤生长，增殖率在3个月内达到46.2倍；6-BA可显著促进愈伤形成类原球茎；培养基添加6-BA 1.0mg/L在3个月内可使100 mg愈伤形成48.4个类原球茎；6-BA和TDZ可促进类原球茎的直接形成，以原球茎为外植体，培养基添加6-BA 0.5mg/L可观察到最高的诱导率和类原球茎形成数; 并且，通过ISSR分子标记检测，通过生长调节剂诱导再生的植株克隆保真度可达99.5%-100%，表明通过微繁流程再生植株在遗传上是稳定的。

总体来看，白及组培快繁技术已获得了系统性进展，已实现快速规模化种苗生产。但组培快繁方法途径多样，接种环节较多，部分研究机构已在尝试大棚种子直播育苗。如何进一步优化培养基、简化工艺流程，提高成活率，降低生产成本，使白及快繁技术日臻完善并对兰科植物快繁通用关键技术做出贡献是后续研究中值得考虑的问题。

4 白及资源再生策略初探

如前所述，白及功效多样，在医疗、保健、美容及其它工业领域的用途不断拓展，资源供求矛盾较为突出。长期以来，白及用药主要利用野生资源，资源利用强度增加导致白及资源逐步匮乏，资源匮乏制约相关产业发展并危害遗传资源安全，国家野生动植物保护已将白及列为Ⅱ级保护植物。对白及野生资源的直接利用不仅违反国家的植物保护法规而且无法标准化，从而制约相关产品的品质提升。因此，白及人工规模化种植必不可少。种质资源研究是人工规模化种植的首要环节。白及物种分布广泛，具有复杂的扩散分化历史，其种质资源因环境异质性而呈现多样化，具有丰富的产量、品质相关遗传变异，具有较大的选育种潜力。加强白及种质资源研究的深度和广度，从生物量、关键化学成分、适生范围等方面进行较为精细的居群比较研究，从野生种质资源中筛选出高产高含量、适生性好的优质种源或专用种质还大有可为。白及繁殖可依靠块茎增殖、种子或组织培养来进行繁殖。鉴于白及种子数量巨大，白及种子培养及组织培养技术亦已获得系统性进展，利用数量庞大的白及种子通过种子培养来进行白及种苗快繁是现阶段白及繁育的最优选择。

白及人工种植较为星散，种植区域分布在滇、黔、川、渝、湘、赣、桂、皖等省。鉴于不同白及种源在生态适应性、化学成分及药用功效方面具有一定的差异，这一种植格局有利于维持白及种质资源的多样性以及药用功效的特型化。因此，从宏观策略上应鼓励多区域、多种源种植。病虫害防治是白及种植成功较为关键的问题。成片连块大规模种植易于发生病虫害。利用中国西南山地高原地区的地形地貌特点发展山地小块种植，对于降低白及种植病虫害防治成本具有很大的优势。白及生产周期较长，从种苗到收获平均需要3-4年。这一生产特点对于急需收获的种植者来说是较大的弊端。但白及为耐阴植物，可用于林下间作。西南山地高原地区具有大量的桃、李、梨、苹果、柑橘、油茶等林木。这些林木往往是单一种植，受市场波动影响较大。将白及用于这些林木种植的林下间作，将在节约耕地以及减缓市场波动影响方面发挥重要作用。另外，林下间作也有利于白及的病虫害防治和综合管护，降低生产成本。因此，种子繁殖、山地小块种植、林下间作将可能成为高效率、低成本、可持续进行白及资源再生的常规措施。

致谢:

感谢杨小生博士、 潘卫东博士对本文给出宝贵意见。