赤红壤条件下宿根甘蔗根际可培养细菌的多样性研究

农泽梅，史国英，曾 泉，叶雪莲，秦华东，胡春锦*

(1.广西大学农学院，广西 南宁 530005；2.广西农业科学院微生物研究所，广西 南宁 530007)

【研究意义】甘蔗(Saccharumofficinarum)是我国重要的糖料作物。宿根蔗栽培是甘蔗的种植生产上一项重要的栽培制度，我国甘蔗宿根年限一般只有1～2年，但国外可达4～7年[1-2]。影响甘蔗宿根年限的主要因素是土壤的质量和甘蔗品种的差异。广西是我国主要甘蔗和蔗糖产区，但该地区的土壤类型(赤红壤)存在耕层薄、肥力偏低、水土养分流失严重等不利因素，超过2年宿根年限甘蔗表现减产比较严重[3]。根际微生物对土壤肥力的形成、植物营养的转化等具有重要作用[4-7]，开展赤红壤条件下宿根甘蔗根际可培养细菌的多样性研究，对充分发挥赤红壤土壤肥力的维持和提高、激发蔗区的生产潜力、选种宿根性良好的甘蔗品种乃至保障我国蔗糖产业健康发展均重要意义。【前人研究进展】关于根际微生物的多样性及其生态功能的研究一直广受关注[4]。土壤微生物群落多样性研究可为合理利用资源、解决农田生态系统失衡提供理论依据，同时，植物根际细菌的研究有利于进一步认识“植物根系―细菌”的共生体系协同进化的机制[8-9]。前人研究表明，作物长期连作会严重降低土壤微生物种类和活性，导致植物根际土壤营养元素活性降低和微生物群落对外界抵抗力降低，甘蔗宿根连作引起产量下降等作物连作障碍与其根际微生态系统失衡有着密切关系，保持土壤微生物活性是缓解和消除宿根甘蔗衰退的重要措施，也是维持蔗田土壤系统稳定性和可持续发展的重要保障[10-11]。据相关研究报道，不同栽培模式条件下，不同甘蔗品种之间的根际微生态环境是存在明显差异的，如单一的宿根连作导致其根际土壤总微生物量及酶活性下降，引起土壤微生物介导的营养循环受阻，从而导致甘蔗产量下降[12-15]。高欣欣等研究发现[11]，宿根甘蔗土壤与新植甘蔗土壤相比，一些具有重要生物学和生态学功能的微生物种群如固氮菌等数量呈下降趋势，但具有代谢甲醇与降解纤维素功能的细菌种群数量有所上升。我国甘蔗主产区的主要耕作土壤类型为红壤土或赤红壤土，具有低pH、低养分含量、硝化与反硝化活性低等特点，因此，高投入的种植模式一直是提高甘蔗产量必不可少的措施[16]。然而，过度依赖投入而忽略自然生态过程的种植模式已然不利于农业的可持续发展，必须重视土壤的改良[17-18]。当前，利用微生物菌剂来解决作物的连作障碍问题已成为农业生产发展中新的热点。向土壤中施入微生物菌对于改善土壤生态环境、提高农作物产量和品质具有极其重要的作用，特别是对于具有低pH、低养分含量和易淋溶特性的红壤或赤红壤土壤类型，通过施用土壤改良剂并结合添加外源微生物菌剂进行土壤微生态环境改良是非常必要的[19-22]。在众多的土壤修复技术中, 添加土壤修复剂以及有益农业微生物菌剂是一种既有效又环保的方法，因为微生物在土壤中物质和能量的输入输出中扮演着非常重要的角色[12-15]。然而，在选用合适的微生物菌剂方面，需要充分考虑到外源微生物与作物以及土壤之间的相互适应问题。一般来说，选用来源与菌剂施用的作物土壤环境具有较高相似性的微生物会表现出更好的适应性。因此，在甘蔗土壤的生态改良上，施用来源于甘蔗根际土壤的功能微生物菌剂会比较有优势。【本研究切入点】关于赤红壤条件下不同品种宿根甘蔗根际可培养细菌种群的差异，以及宿根蔗根际潜在可利用微生物菌种资源的挖掘和利用，目前还缺乏系统的研究报道。【拟解决的关键问题】拟通过纯培养法和基于 16S rDNA 基因序列的系统发育分析对同时种植在赤红壤条件下、连续留宿根2年的10个甘蔗品种工艺成熟前期的根际可培养细菌的多样性进行研究，以期为明确我国主要蔗区宿根甘蔗根际细菌的多样性、挖掘更多的优良甘蔗根际细菌资源提供科学支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于广西农业科学院试验地(N 22°50′38.08″，E 108°14′44.65″)开展试验，试验地土壤类型为赤红壤土，土壤的基本养分情况见表1。

供试甘蔗品种为10个来源于不同国家或地区的品种材料：RB86-7515(简称B8，引自巴西)和桂引B9(简称B9)、桂糖21号(GT21)、桂糖35号(简称GT35)、桂糖40(GT40)、桂糖41号(GT41)、桂糖42号(GT42)、桂糖43号(GT43)、新台糖22号(简称ROC22)和粤糖93159(简称YT93159)。

表1 供试土壤的基本养分情况分析

供试牛肉膏蛋白胨培养基NA以及细菌基础液体培养基LB参照相应的参考文献进行配制[23]。

1.2 试验方法

甘蔗的种植管理：10个甘蔗品种同时种植在广西农业科学院的试验地，甘蔗按常规的种植管理，采用随机排列，种植10个甘蔗品种，连续留宿根2年。取样分离甘蔗根际细菌的时期为2年宿根甘蔗的工艺成熟前期，取根际土壤进行细菌分离培养。土壤样品采用五点取样法，宿根蔗大多已长成一整丛，因此，采样时要先去除大约5 cm的表土，再将宿根蔗整兜挖起来，然后收集附着于根系上的土壤，五点土样混合为一份，去除须根和腐叶等杂质并过筛，最后分别装入无菌袋，贴上标签，带回实验室进行根际细菌分离。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 根际细菌的分离、计数和纯化 称取根际土样5 g，用45 mL无菌水稀释混匀，28 ℃120 r/min摇床温化培养3 h，然后取100 μl加入900 μl无菌水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6进行梯度稀释，分别取梯度10-4、10-5和10-6的稀释液100 μl均匀涂布在NA培养基平板上，28 ℃培养2 d后进行菌落计数，挑取培养性状不同的单菌落在NA培养基上连续纯化2～3次，最后挑取纯化以后的单菌落，转至 NA 斜面培养1～2 d，一份放置于4 ℃短期保存备用；另一份将菌苔刮下与40 %甘油混合，置于-80 ℃冰箱长期保存。所有菌株均保存于广西农业科学院微生物研究所植物微生态菌种保藏室。

1.3.2 根际细菌的16S rDNA序列分析 PCR扩增模板制备： 将供试菌株接种到LB液体培养基培养 20 h后离心收集菌体备用。用细菌基因组DNA提取试剂盒，按产品说明书从供试菌株的LB培养物中提取小量基因组 DNA，保存于-20 ℃备用。利用细菌16S 通用引物，正向：27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)，反向：1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)，扩增所有供试菌株的16S rDNA 基因。PCR扩增按史国英等[24]的方法进行。扩增产物经电泳检测和纯化后，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上进行同源性比对。从Gen Bank数据库获得最相近的典型菌株的16S rDNA序列，用Clustal X按照最大同源性的原则进行排序，并用Neighbor-join法构建系统进化树[25]。

1.3.3 根际可培养细菌种群的多样性分析 根据菌株16S rDNA序列分析结果对所分离获得的根际细菌进行种属分类，利用群落数学生态学的研究方法分析和比较甘蔗不同品种根际可培养细菌的多样性。细菌多样性分析参考任强等[26]的方法，采用Marglef丰富度指数，Shannon-Wiener多样性指数表示，指数计算公式如下：

(1) Marglef丰富度指数dma：dma=(S-1)/lnN

式中,S为物种数目，N为所有物种的个体数之和。

(2) Shannon-Wiener多样性指数H′：H′ =-∑PilnPi

式中,Pi=Ni/N，Ni为第i种的个体数。

群落中生物种类越多代表群落的复杂程度增高，即H′值愈大，多样性越高，群落所含的信息量愈丰富。

1.4 统计分析

采用Excel 2007对数据进行整理及制图，并以SPSS 18.1对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种甘蔗宿根蔗根际细菌的多样性比较

利用NA培养基对10个不同品种宿根蔗根际土壤样品进行细菌分离和纯化，共获得167株根际细菌，结果见表2；菌株编号为N15101～N15300，其中甘蔗品种B8和YT93159的可培养根际细菌的数量最多，而B9的根际细菌数量最少。从表2可见，不同甘蔗品种根际细菌群落的丰富度指数(dma)、Shannon-Wiener 多样性指数(H′)，存在显著差异(P<0.05)，丰富度指数为1.8034～3.6719，Shannon-Wiener多样性指数则为1.1730～2.3161，其中以甘蔗品种B8的菌株个体数、丰富度指数和多样性指数均为最高；其次为品种GT43，它的根际细菌丰富度指数和多样性指数分别为3.2461和2.1661；品种YT93159的根际细菌菌株个数虽然也比较多，但其多样性指数仅为1.61；品种GT43的根际细菌多样性指数最低，仅为1.1730。

2.2 甘蔗根际细菌多样性分析

对所有获得的可培养根际细菌均进行了16S rDNA扩增和测序，序列通过 BLAST 程序与Gen Bank数据库中已报道的16S rDNA序列进行相似性比对分析。所有供试菌株与Gen Bank中已报道菌株均具有较高的相似性(≥97 %)，167株甘蔗根际细菌在种属水平上，可以划分为31个不同分类单元，即可归类于31个不同菌属(表3和图1)。

2.3 甘蔗根际细菌的系统发育学分析

选取31个不同菌属的代表菌株及其相似性最高菌株的16S rDNA序列构建系统发育树(图2)。16S rDNA序列分析结果表明，167株宿根蔗根际细菌主要分属于厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)4大类群(表3，图 2)。类群Firmicutes主要包含Bacillussp.、Paenibacillussp.、Paenisporosarcinasp.和Lysinibacillussp.等菌属，其中Bacillussp.是所有可培养根际细菌中的最优势菌属，占41.92 %；类群Bacteroidetes主要包含Chryseobacteriumsp.、Pedobactersp.、Flavobacteriumsp.、Chitinophagasp.、Olivibactersp.、Niabellasp.等菌属，其中Chryseobacteriumsp.是所有分离菌株中的第二大优势菌属，占10.78 %；类群Actinobacteria只包含Microbacteriumsp.、Streptomycessp.、Micrococcus sp.等菌属，均为非优势菌；类群Proteobacteria包含的菌属最多，共有Enterobactersp.、Acinetobactersp.、Pseudomonassp.、Ensifersp.、Achromobactersp.、Stenotrophomonassp.等18个菌属，都属于非优势菌属，仅在部分或者个别甘蔗品种的根际分离获得，但Acinetobactersp.在甘蔗品种GT40的根际细菌中属于优势菌属，占该品种可培养根际细菌种群的29.4 %。

表2 不同品种宿根蔗根际细菌的多样性比较

注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异达显著水平(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in same column represented significant difference at 0.05 level.

表3 不同品种甘蔗根际细菌基于16S rDNA序列分析的分类鉴定结果

续表3 Continued table 3

序号Serial number菌属种类Species of bacteria genera不同品种甘蔗根际细菌菌株数量Rhizosphere bacteria stains number of different varieties sugarcaneGT21B8GT35GT43GT41ROC22B9GT42GT40YT9315924Niabella sp.000100000025Kosakonia sp.000010000026Micrococcus sp.000001000027Caulobacter sp.000000100028Cronobacter sp.000000000129Sphingobium sp.000000000130Pseudoxanthomonas sp.000000100031Escherichia sp.0000000010 合计 Total16201516161714161720

图1 来源于10个不同品种宿根蔗根际细菌的主要种属类群饼状图Fig.1 The pie chart owning to the taxonomy of rhizosphere bacteria from 10 ratoon sugarcane cultivars

3 讨 论

3.1 不同品种宿根甘蔗根际细菌多样性的差异

根际是土壤中围绕着植物根的一个狭窄的区域。由于根系分泌物的选择作用，通常根际微生物的种类较少[27]。本研究从10个种植在赤红壤条件下宿根甘蔗的根际土壤中分离获得167株根际细菌，它们在基于16S rDNA序列分析结果上属于31个不同的菌属。该结果显示2年宿根蔗根际细菌还是比较丰富的，但其主要优势菌群比较单一，最大的优势菌属是芽孢杆菌属(Bacillussp.)，占所有可培养根际细菌的41.92 %，其次为金黄杆菌属(Chryseobacteriumsp.)，占10.78 %，其它29个菌属的菌株数量占比均不高，仅在部分或者个别甘蔗品种的根际土壤中分离获得。究其原因可能是由于宿根蔗根系土壤的营养与化学环境相对比较稳定，有利于根系环境中优势微生物菌群的发展，但是，相对稳定的根系环境又容易使菌群趁于单一，并不利于维持根系微生物的多样性。本研究在一定程度上反映了不同甘蔗品种间根系微生态区系的差异，如10个甘蔗品种的根际细菌群落丰富度指数在1.8034～3.6719，表现为B8>GT43>GT42>ROC22>GT40>YT93159>GT41>B9>GT21>GT35；Shannon多样性指数为1.1730～2.3161，其中除了品种桂引B8和GT43的多样性指数分别达到2.3161和2.1661以外，其它8个品种的H′均低于2.0，多样性指数最低的是GT35，仅为1.1730。前人研究结果表明，微生物多样性的降低以及结构失衡是导致植物根际土壤营养元素活性降低和微生物群落对外界抵抗力降低的重要原因，维持作物根际土壤微生物群落结构稳定性，保持微生物活性是缓解和消除宿根甘蔗衰退的重要措施，也是维持蔗田土壤系统稳定性和可持续发展的重要保障[1, 11, 28]。因此，从本研究结果来看，甘蔗品种B8和GT43相比较其它8个品种表现出良好的宿根性优势。该结果为进一步研究“甘蔗―根际细菌”的互作及其协同进化关系提供了一定的理论依据。但是，由于影响甘蔗宿根年限的主要因子众多，如土壤营养失调、根系分泌物积累、土壤微生物区系变化以及病虫害发生等，而本研究只分析了根际可培养细菌这一项指标，未能全面反映甘蔗根系微生物的变化，因此，不同品种根际可培养细菌菌群的差异是否与甘蔗的宿根性相关？在土壤微生态环境改良的措施上，品种选择是否可以作为一个重要的参考指标？相关问题仍有等进一步的研究。由于自然界中只有0.1 %～1 %的微生物能通过常规方法能被培养，仅占自然界中微生物种类的极小部分[29]。因此，在今后的进一步研究中，应采用多种培养基对样品进行分离培养，并结合利用不依赖纯培养的分子生物学的方法来研究根际未培养或不能培养的微生物，才能更全面地了解宿根甘蔗的根际微生物种群信息。

3.2 宿根甘蔗根际细菌中具有潜在利用价值的菌种资源

本研究从宿根甘蔗的根际土壤中分离获得167株可培养根际细菌，在基于16S rDNA序列分析结果上属于31个不同的菌属，其中最大优势种群为芽孢杆菌属(Bacillussp.)，占41.92 %，表明宿根甘蔗根际细菌中可能存在许多具有应用潜力的菌种资源，是根际促生细菌的重要资源库。Bacillussp.属内的多种细菌在农业上已得到广泛利用。如巨大芽孢杆菌(B.megaterium)是一种解磷促钾细菌，能够分解土壤中的吸附态有机磷、无机磷；阿氏芽孢杆菌(B.aryabhattai)具有较强的纤维素分解能力[30-32]。这 2种细菌作为优势种群存在于土壤细菌中，有利于土壤中磷和纤维素的分解，提高土壤肥力，促进作物的生产。此外，芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、甲基营养芽孢杆菌(B.methylotrophicus)等细菌对植物病原真菌或病原细菌具有抑制作用，是具有较好开发应用前景的生防细菌[33-34]。本研究获得的宿根甘蔗根际细菌的另一个主要优势菌群黄金杆菌属(Chryseobacteriumsp.)的许多种也是重要的有机物降解菌，具有降解土壤中残留化学农药等生物学功能；而其它主要菌群，如假单胞菌属(Pseudomonassp.)、土地杆菌属(Pedobactersp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillussp.)和微杆菌(Microbacteriumsp.)等菌属的许多种均具有固氮、生防和促进植物生长等重要生物学和生态学功能[35-36]。这些菌群在开发新型微生物肥料、研制高效微生物农药或者作为微生物接种剂促进农作物生长以及通过微生物降解来治理环境、改善农业生态环境的上都具有良好的应用潜力。宿根甘蔗根际细菌的主要种群中包含许多具有潜在应用价值的微生物菌种资源。本研究结果可为进一步研究“甘蔗―根际细菌”的互作及其协同进化关系提供理论依据。

4 结 论

本研究反映了赤红壤条件下宿根甘蔗根际具有丰富的可培养细菌多样性，但是优势菌群比较单一，不同甘蔗品种间存在显著差异，其中甘蔗品种B8和GT43根际细菌群落的丰富度指数和多样性指数均相比较高，具有维持宿根甘蔗根际土壤微生物群落结构稳定性的相对优势。