贵州黔南喀斯特洞穴放线菌抗菌活性筛选及差异研究*

牛雪可， 兰永哲， 李文均， 曹煜， 黄劲， 廖万清， 康颖倩*

(1.贵州医科大学 基础医学院 微生物学教研室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学 贵州省微生物与人类健康关系研究人才基地暨贵州省普通高校病原生物学特色重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 3.中山大学 生命科学学院, 广东 广州 510275； 4.贵州医科大学附院 皮肤科， 贵州 贵阳 550004； 5.第二军医大学上海长征医院 真菌学研究所， 上海 200003)

在深海热液口发现的、以化能无机营养生物为基础的生态系统已颠覆了所有生命都依赖于光的理论[1]，喀斯特洞穴作为极端环境中一种特殊的生态系统，具有黑暗、对流交换缓慢、营养物质匮乏等特点，洞穴环境虽特殊但仍有大量生理功能特殊和耐受适应的生物存在，且多样性丰富[2]。由于地理条件的限制，大多数洞穴未被探测或极难进入，因此受到外界环境干扰少，能够较好的保持其原始性，洞穴内常生存着一些能够耐受极端环境的微生物，且微生物还处于较为原始的抗药性阶段，可以在其中寻找天然的抗菌药物。目前贵州省喀斯特地区放线菌研究主要集中在土壤放线菌生物多样性[3-5]、喀斯特环境与微生物的相互作用方面，对天然喀斯特洞穴内放线菌生物多样性及抗菌活性研究有限，而位于贵州荔波县的茂兰国家级喀斯特森林自然保护区，是我国中亚热带喀斯特地貌上原生性森林植被保存较完好的一块宝地，本实验从茂兰喀斯特天然洞穴中采集样本，对原生态微生物进行纯培养，选择真菌、细菌、放线菌中5种致病菌进行放线菌的抗菌活性研究，为贵州省放线菌的分类及资源开发提供研究资料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1样品 2018年8～9月于贵州省荔波市茂兰喀斯特森林无名洞穴内采集，置于无菌纸袋中，运回实验室4 ℃保存。

1.1.2培养基 发酵培养基1(AM3)：可溶性淀粉10 g, 大豆粉10 g, 甘油10 g,蛋白胨15 g,CaCO32 g。发酵培养基2(RA)：可溶性淀粉20 g,葡萄糖10 g,麦芽提取物10 g,麦芽糖 10 g,玉米粉5 g，微量元素100 U/L,CaCO32 g。发酵培养基3(ISP5)：葡萄糖10 g,酵母提取物4 g,麦芽提取物10 g。 纯化培养基(TSA)：大豆蛋白胨5 g,胰蛋白胨15 g,NaCl 15 g，琼脂 15 g。

1.1.3测试病原微生物 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923、大肠埃希菌(Escherichiacoli)ATCC25922、白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC10231、新生隐球菌(Cryptococcusneformans)H99、土地戈登氏菌(Gordoniaterrae)IFM 161，大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌为贵州医科大学微生物学教研室保存菌株，其余均获赠于日本千叶大学真菌研究所。

1.1.4主要试剂 TIANGEN®细菌基因组DNA提取试剂盒、Genstar®PCR MIX、国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1放线菌分离 将土壤样本风干研磨后，使用无菌水制成10-2土壤悬液，取200 μL涂布于分离平板上，28 ℃培养7 d，观察生长菌落的形态特征，挑取单菌落接种于TSA板进行纯化，28 ℃培养4～5 d，直至获得单一纯菌。

1.2.2基因组DNA提取及16S rRNA扩增 采用细菌基因组DNA提取试剂盒制备DNA模板，采用16S rRNA通用引物[6]27f(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)1492r(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)进行PCR扩增，反应体系及条件参照文献 [7]。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后送英淮捷基(上海)贸易有限公司进行序列测定。

1.2.316S rRNA 基因比对 将获得的序列在CLUSTAL_X program进行比对后[8]，与现有的纯培养序列在NCBI 数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)及EzTaxon-e 工具进行比对[9]。

1.2.4抗菌活性实验 将筛选出的放线菌每株接种于AM3、RA、ISP5三种不同的培养基中，置于28 ℃摇床中发酵1周，10 000 r/min离心取上清,过0.22 μm滤膜，获得发酵液。将病原菌活化后，制成菌悬液(0.5麦氏)，均匀涂布于无菌PDA/TAS平板上，使用管碟法[10]，于37 ℃正置培养24～48 h。十字交叉法记录抑菌圈直径。

2 结果

2.1 分离到的放线菌

从茂兰喀斯特洞穴样品中共分到35株放线菌，归属于放线菌门下3个目5个科9个属22个种，其中优势菌属为Rhodococcus属(45.7%)，Arthrobacter属(17.1%)。见表1。

表1 贵州荔波茂兰喀斯特森林无名洞穴放线菌分离结果Tab.1 Actinomycetes isolation result in Kast caves

2.2 抗菌活性

35株放线菌中15株对至少一种病原菌具有抑制作用，占比42.8%，其中编号为K1028、K1006、K2049的菌株对白念珠菌有抑制作用，尤其K1028菌株抑制作用最强，属于微杆菌属；9株放线菌对新生隐球菌有抑制作用，其中K4211-2(巴氏杆菌)、K4213(厄氏菌属)、K4239-2(链霉菌属)表现出了极强的抑制作用；K4239-2(链霉菌属)及K3102(链霉菌属)、K4212-3(红球菌属)对戈登氏菌具有抑制作用；K3218-1、K417对金黄色葡萄球菌具有抑制作用，K4213、K417、K3219、K2010对大肠埃希菌具有抑制作用。见表2。

表2 分离放线菌对5种病原菌抗菌活性Tab.2 Antibacteria activity of actinomycetes

续表

菌株编号发酵培养基Cryptococcus neformansCandida albicansGordonia terraeStaphylococcus aureusEscherichia coli1+----K4412----3++----1-++---K20492-----3-----1++----K20312++----3+----1-----K31022-----3--++--1-----K4172---+++++3----1----+++K32192-----3-----1-----K20102-----3----+++

注:+++表示抑菌圈直径>25 mm， ++表示抑菌圈直径15 mm～25 mm， +为抑菌圈直径<15 mm， -表示无抑菌圈

2.3 不同培养基获得抗菌活性的差异

在抗菌活性试验中，同一菌株使用不同的培养基发酵，其代谢产物对同一病原菌的抗菌活性差异显著。15株活性菌株中，在AM3培养基中具有抗菌活性的菌株有8株，占53.3%，ISP5培养基有抗菌活性菌株数量与AM3相同，RA培养基有抗菌活性菌株数量为5株，占比33.3%。见图1、图2。

注：A为E.coli，B为S.aureus，C为G.terrae，D为C.neformans，E为C.albicans图1 放线菌在不同培养基发酵条件下的抑菌谱Fig.1 Antimicrobial spectrum of actinomycetes under different fermentation conditions

注：A为K1032菌株3号发酵液对Gordonia terrae的抑制作用，B为K441菌株3号发酵液对Cryptococcus neformans的抑制作用，C为K1028菌株2号发酵液对Candida albicans的抑制作用，D为K2049菌株1号发酵液对Candida albicans的抑制作用图2 部分菌株在不同发酵培养条件下的抑菌情况Fig.2 Difference antimicrobial activity under different culture condition

3 讨论

本研究首次对贵州茂兰喀斯特森林内的洞穴进行了放线菌类群的分离鉴定及抗菌活性筛选研究，选择使用了3种不同的发酵培养基(RA、ISP5、AM3)对放线菌产生抗菌活性差异的影响因素进行了比较和探讨。共分离获得35株可培养放线菌，其中棒杆菌目和微球菌目所占比例各半，优势菌属为红球菌属(45.7%)、其次为节杆菌属(17.1%)，另有少量的链霉菌属，而湖北、云南、河南等地洞穴放线菌优势菌属为链霉菌属[11-13]，表明微生物群落多样性存在地域性差异。在分离到的放线菌中42.8%的菌株表现出了抗菌活性，尤其是对病原真菌有较强的抑制作用。抗真菌抗生素的发展一直较抗细菌抗生素缓慢[14]。近年来，随着 HIV 感染的蔓延、免疫抑制剂的广泛使用、免疫功能低下患者的增加、人口的老龄化、器官移植等医疗技术的发展以及留置医疗器械的广泛使用等，导致侵袭性真菌感染的发病率及耐药率逐渐升高[15-16]。侵袭性真菌感染不仅能造成皮肤、黏膜的浅表感染，还能造成免疫功能低下患者致命的系统感染。有学者从肺癌、艾滋病、慢性粒细胞白血病等样本中分离出大量念珠菌[17-18]，成为医院感染排名第四位的病原菌[19]，也是导致血液、肿瘤和 ICU 病房患者最主要的死亡原因之一，致死率达到 40%～60%[20]。白念珠菌感染的日益流行及其较高的致死率一直都是人们关注的。本研究发现了多株对念珠菌及隐球菌具有抑制作用的活性菌株，研究结果有助于天然、高效、广谱、抗真菌抗生素的开发，具有巨大的利用价值。

本次研究使用的3种发酵培养基，碳氮源的成分的差异影响了放线菌抗菌活性。碳源和氮源是影响微生物代谢的重要因素，从AM3及ISP5培养基发酵产物中获得具有抗性菌株的比例高于RA培养基。考虑单因素影响，促进放线菌抗菌活性物质产生的最佳碳源为玉米粉其次为可溶性淀粉及葡萄糖，最佳氮源为蛋白胨其次为黄豆粉酵母粉[21-24]。本次洞穴中分离到的放线菌在使用葡萄糖作为碳源或麦芽提取物作为氮源的培养基发酵时，产生具有抗菌活性的物质量少或无抗菌活性的物质产生，一方面提示麦芽提取物并非理想的洞穴放线菌活性物质产生的营养因子，另一方面说明淀粉作为碳源有利于发酵液中活性物质的产生和代谢[25]，培养基的碳氮源差异最终导致分离到的放线菌的代谢谱变化，使抑菌活性更强或失去了抑菌活性。因此在进行洞穴放线菌活性筛选时，可以选择黄豆粉、酵母粉等复合氮源，其中不仅含糖，氮素和灰分，还含有促进放线菌生成及孢子萌发的生长因素，可以促进新的天然活性产物的发现[26]。

综上所述，本研究对黔南喀斯特洞穴极端环境的放线菌资源进行了初步调查，分离得到了具有潜在开发利用价值的放线菌资源，对当地放线菌微生物资源的开发和保护有重要的意义。