瞿麦对肾癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的调控

董建设 赵俊峰 张林超 陈瑞廷 贾占奎 杨锦建

(1河南省中医院泌尿外科，河南 郑州 450000；2郑州大学第一附属医院泌尿外科)

肾细胞癌(RCC)又称肾癌，是常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，起源于肾实质，多发生于中老年人，男性患者多于女性。近年来肾癌患病率呈现出明显的上升趋势〔1〕。肾癌治疗方式以手术切除辅以放化疗的综合治疗方式为主，但放化疗对患者产生较大的副作用，且患者易产生放射不敏感性及耐药性，大大影响后期放化疗效果〔2,3〕。因此，寻找新的治疗方式对于改善肾癌的治疗现状显得尤为重要。近年来采用中药辅助治疗肿瘤的研究成为国内外学者的研究热点〔4〕。瞿麦是石竹属植物，是传统的中药材，具有破骨涌经、清热、利尿的功效。研究表明，瞿麦具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化免疫调节等多种药理作用〔5,6〕。从瞿麦中分离出的环肽化合物对肝癌、乳腺癌、肺癌具有较好的抗肿瘤作用〔7〕；从瞿麦中分离的黄酮类化合物可通过细胞内线粒体凋亡途径诱导人体表皮细胞癌细胞的凋亡〔8〕，还可抑制人子宫内膜癌细胞增殖〔9〕。本实验通过瞿麦干预肾人癌细胞，对细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响进行研究，并对其作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1材料 人肾癌细胞786-0购于中国科学院上海生命科学院细胞库；瞿麦根提取物购于兰州沃特莱斯生物科技有限公司，纯度为99%；胎牛血清、RPMI1640培养基、胰蛋白酶、MTT购于美国Sigma公司；青霉素、链霉素购于杭州四季青生物工程材料有限公司；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR检测试剂盒购于大连宝生物工程有限公司；膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡试剂盒购于江苏凯基生物科技股份有限公司；实验所用引物由上海生工生物工程技术股份有限公司合成；BCA蛋白定量试剂盒、电化学发光(ECL)底物购于上海炎熙生物科技有限公司；钙黏附蛋白E(E-cadherin)单抗、神经性钙黏附素(N-cadherin)单抗和波形蛋白(Vimentin)单抗均购于美国Epitomics公司。

1.2肾癌细胞培养 人肾癌细胞786-0培养用含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素的RPMI1640培养基，培养条件为体积分数5%的CO2、饱和湿度、37℃恒温细胞培养箱，取处于对数生长期的肾癌细胞进行实验。

1.3MTT检测肾癌细胞增殖能力 取对数生长期的肾癌细胞接种于96孔细胞培养板中，接种密度为3×103个/孔，继续培养待细胞贴壁生长后，去除原培养基，添加含不同浓度的瞿麦根提取液的培养液，各组对应浓度分别为0.0 μg/ml、12.5 μg/ml、25.0 μg/ml、50.0 μg/ml、100.0 μg/ml，每组设置5个平行复孔。在加入含瞿麦的培养基后24、48 h时，分别在细胞培养孔中加入0.5 mg/ml的MTT溶液200 μl，置于37℃条件下继续孵育4 h。吸取上清后，再在每孔中加入二甲基亚砜 100 μl，缓慢摇动孵育10 min。使用酶标仪测定各组细胞在450 nm波长处的吸光度值(A值)。计算各组细胞增殖抑制率。以0.0 μg/ml组测得的A值为对照计算百分比，抑制率=1-(实验组A值/对照组A值)×100%。

1.4流式细胞术检测肾癌细胞凋亡率 选取对数生长期的肾癌细胞，将细胞随机分为3组，分别为对照组(0 μg/ml组)、药物组(分别给予50 μg/ml、100 μg/ml浓度的瞿麦处理肾癌细胞)。待细胞处理48 h后，用胰蛋白酶消化各组细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，用结合缓冲液重悬细胞制成单细胞悬液，调整各组细胞量约为1×105个，加入Annexin V-FITC 5 μl混匀后，再加入PI 5 μl，于室温下反应15 min后，采用流式细胞仪测定各组肾癌细胞凋亡率。

1.5qRT-PCR检测肾癌细胞中Bax和Bcl-2表达水平 各组肾癌细胞分别培养48 h以后，按照Trizol提取RNA试剂盒提取各组肾癌细胞总RNA，提取的RNA经浓度和纯度检测，A260/A280值为1.98，保证了RNA提取的完整性，可用于后续实验。采用碧波逆转录酶(M-MLV)反转录试剂盒合成cDNA，用实时荧光定量PCR检测试剂盒进行荧光定量PCR，采用20 μl反应体系〔SYBR Green 10 μl，cDNA模板4 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，焦碳酸二乙酯(DEPC)-H2O 4 μl〕，反应为40个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为参照，用相对定量2-△△CT分析Bax和Bcl-2的表达水平。

1.6划痕实验检测肾癌细胞迁移能力 用记号笔在细胞培养板底部均匀划数条横线，保证所划横线穿过细胞培养孔。将各组处于生长对数期的肾癌细胞接种于6孔培养板中，以无血清培养基饥饿处理12 h，用灭菌过的100 μl移液枪枪头垂直于横线划出均匀的细胞划痕，用PBS洗涤划下的细胞及细胞碎片，加入含10%血清的培养液，加入相应浓度的瞿麦(终浓度为50 μg/ml和100 μg/ml)，于划痕48 h后，在划痕处拍照记录细胞迁移结果。

1.7Transwell实验检测肾癌细胞侵袭能力 在Transwell小室的聚碳酸酯膜上加入稀释过的基质胶60 μl，置超净工作台中使基质胶过夜聚合重建基膜。取对数生长期的肾癌细胞以PBS洗涤3次，用不含血清的培养液重悬细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为5×104/L，在Transwell上室加入细胞悬液100 μl，各组细胞中加入不同浓度的瞿麦至终浓度为0、50、100 μg/ml，在下室加入含10%血清的培养液500 μl，置于37℃培养箱中培养48 h。弃去培养液取出小室，用棉签拭去上室的细胞，用40 ml/L的多聚甲醛固定10 min，用1 ml/L的结晶紫染色15 min，在倒置显微镜下计数穿膜细胞个数，以穿膜细胞数表示细胞的侵袭能力。

1.8Western印迹检测肾癌细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达水平 处于对数生长期的肾癌细胞分别加入浓度为0、50、100 μg/ml的瞿麦，培养48 h后，去除培养液后用PBS洗涤细胞3次，每孔细胞中加入苯甲基磺酰氟(PMSF)裂解液150 μl，置冰上裂解30 min。用细胞刮把细胞刮落收集至EP管内，10 715 r/min离心10 min收集上清。用BCA法对蛋白进行定量测定。每个泳道孔加入50 μg变性的蛋白样品，以5%的浓缩胶、12%的分离胶电泳分离蛋白，以半干法转膜，转膜条件为80 V电压，4℃转膜120 min。以5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭60 min。分别加入E-cadherin(1∶800稀释)、N-cadherin(1∶800稀释)和Vimentin(1∶500稀释)的一抗在4℃中过夜反应，用PBS洗涤后，加入二抗在室温中继续孵育2 h。采用ECL化学发光，成像系统中扫描图像，以每组肾癌细胞中GAPDH灰度值为参照，分析各组肾癌细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平。

1.9统计学分析 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1瞿麦对肾癌细胞增殖抑制的影响 随着瞿麦浓度的升高，肾癌细胞增殖抑制率也明显升高，呈现出一定的浓度依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05)。当瞿麦浓度到达100 μg/ml时，对肾癌细胞抑制率最高。随着瞿麦作用时间的延长，50 μg/ml和100 μg/ml组肾癌细胞增殖抑制率明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2瞿麦对肾癌细胞凋亡的影响 0、50、100 μg/ml组肾癌细胞凋亡率分别为(4.52±0.51)%、(26.48±3.16)%、(57.97±6.06)%，随着瞿麦浓度的升高，肾癌细胞凋亡率也显著升高，呈现出一定的浓度依赖性，与0 μg/ml组相比，50、100 μg/ml组细胞凋亡率显著升高，与50 μg/ml组相比，100 μg/ml组细胞凋亡率显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3瞿麦对肾癌细胞中Bax和Bcl-2表达的影响 50、100 μg/ml组肾癌细胞中Bax、Bcl-2 mRNA表达，与0 μg/ml组相比差异具有统计学意义(P<0.05)；50 μg/ml与100 μg/ml组比较，Bax、Bcl-2 mRNA差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 不同浓度瞿麦对肾癌细胞的增殖抑制率比较

与0 μg/ml组比较：1)P<0.05；与12.5 μg/ml组比较，2)P<0.05；与25 μg/ml组比，3)P<0.05；与50 μg/ml组比，4)P<0.05；与同浓度24 h比较：5)P<0.05

表2 不同浓度瞿麦对肾癌细胞中Bax和Bcl-2相对表达量的影响

与0 μg/ml组比较：1)P<0.05；与50 μg/ml组比较：2)P<0.05；表3、4同

2.4瞿麦对肾癌细胞侵袭和迁移能力的影响 与0 μg/ml组比较，50、100 μg/ml组迁移距离及穿膜细胞数均显著减少(P<0.05)；与50 μg/ml组比较，100 μg/ml组迁移距离及穿膜细胞数均显著减少(P<0.05)。见表3。

表3 不同浓度瞿麦对肾癌细胞侵袭和迁移的能力的影响

2.5瞿麦对肾癌细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达水平的影响 与0 μg/ml组比较，50、100 μg/ml组显著抑制N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平，上调E-cadherin蛋白的表达，随着瞿麦浓度的增加，N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平逐渐降低，E-cadherin蛋白表达水平逐渐升高，组间E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1，表4。

表4 不同浓度瞿麦对肾癌细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平的影响

3 讨 论

肾癌是常见的泌尿系统的恶性肿瘤之一，流行病学表明肾癌的发病相关的因素可能有遗传、肥胖、吸烟及高血压等有关，引发肾癌发生的具体分子机制目前还不十分明确〔10〕。目前治疗肾癌的手段主要有手术治疗、放疗和化疗，放疗和化疗毒副作用较大，而中药不仅具有抗癌作用，毒性和不良反应少，还可减轻患者放疗和化疗后的一些不良反应，因此，中药受到越来越多的研究者关注〔11,12〕。研究表明，从瞿麦中分离的多种活性物质可发挥抗癌作用〔13〕。从瞿麦中分离的水杨酰胺衍生物可通过抑制表皮生长因子受体激酶的激活，起到对人肝癌细胞HepG2增殖抑制的作用〔14〕。对瞿麦根部位采用石油醚萃取，提取的瞿麦活性物质处理人食道癌细胞，发现食道癌细胞增殖抑制率明显升高，说明瞿麦可抑制人食道癌细胞增殖〔15〕。体外培养胃癌细胞BGC-823，用瞿麦分离物槲皮素作用于胃癌细胞，碘化吡啶染色结果显示，胃癌细胞发生凋亡〔16〕。本实验结果显示瞿麦处理后肾癌细胞增殖受到抑制，凋亡率升高，说明瞿麦可抑制肾癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，与上述研究类似。

细胞凋亡是由凋亡相关基因所调控的细胞自主的有序的死亡，目前研究较多凋亡相关的基因是Bax和Bcl-2〔17〕。Bax是一类促凋亡的基因，可促进细胞色素C的释放，参与细胞中钙离子浓度的调节，当Bax表达量增多往往导致细胞凋亡〔18〕。Bcl-2是一种抗凋亡基因，通常与Bax形成二聚体，当Bcl-2的表达减少时，Bax /Bcl-2比值升高，可诱导细胞凋亡〔19〕。对瞿麦有效活性物质提取后处理人胃癌细胞，采用流式细胞仪和Western印迹检测细胞中半胱天冬酶以及Bax和Bcl-2基因表达量的测定，发现半胱天冬酶和Bax发生上调，Bcl-2发生下调〔20〕。本实验对瞿麦处理的肾癌细胞中Bax和Bcl-2 mRNA的表达检测结果显示，Bax的表达显著升高，Bcl-2的表达明显降低，且细胞凋亡率升高，提示瞿麦诱导肾癌细胞凋亡与Bax和Bcl-2的表达有关。

上皮细胞-间充质转化(EMT)是上皮细胞之间失去接触联系转化为间充质细胞表型的一系列可逆的变化。通过EMT导致上皮细胞失去基底膜的连接，获得较高的侵袭和迁移能力〔21〕。EMT在癌症转移、慢性炎症及多种纤维化疾病中具有重要作用。上皮细胞特异性结合蛋白即细胞黏附分子E-cadherin蛋白表达减少，间充质细胞特性蛋白Vimentin、N-cadherin的表达增多，导致EMT的发生〔22〕。目前认为，EMT发生或减少的可靠的蛋白分子标志是Vimentin、N-cadherin和E-cadherin〔23〕。研究表明，IL-33刺激肾癌786-0细胞后可诱导细胞发生EMT，促进786-0细胞侵袭和迁移〔24〕。瞿麦等中药用于治疗膀胱癌可抑制癌细胞发生扩散〔25〕。本研究中，用瞿麦处理肾癌细胞，细胞中E-cadherin蛋白表达增加，Vimentin、N-cadherin蛋白表达减少，说明瞿麦抑制EMT的发生，对瞿麦干扰的肾癌细胞侵袭和转移的能力进行检测，发现细胞侵袭和转移的能力都减弱。提示瞿麦是通过抑制EMT的发生抑制肾癌细胞侵袭和转移的能力。

综上，瞿麦可以抑制肾癌细胞增殖、侵袭和迁移能力，促进肾癌细胞凋亡，其作用机制与Bax、Bcl-2基因及E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白表达有关。为进一步研究瞿麦抗癌作用奠定基础，可为肾癌的治疗提供新的作用靶点。