表没食子儿茶素没食子酸酯-补骨脂脂质体的制备及体外透皮性质研究

宋 娟 吕成志 王 栋 丁 峰 于绪东

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶提取物茶多酚的主要活性成分，约占儿茶素总含量的80%。研究发现，EGCG作为一种天然的抗氧剂，能够清除机体内的活性氧，有效地抑制氧化应激，从而保护黑素细胞[1]。另一种中药材补骨脂是较强的黑色素促进剂，能增强皮肤对紫外线的效应，使酪氨酸酶活性增加，促进黑色素的形成和转运[2,3]。因此，联合应用天然无毒的EGCG和补骨脂对白癜风的治疗具有很高的临床价值，然而，补骨脂中的异补骨脂素为水难溶性药物，存在皮肤渗透性差的缺陷，生物利用度低，致使其很难渗透至皮肤深层，EGCG较差的稳定性及较弱的皮肤渗透性进一步限制了其在白癜风治疗中的应用。脂质体是由脂质双分子层组成闭合囊泡，具有生物相容性好、制备工艺简单、同时包载水溶性和脂溶性的药物、性质稳定、皮肤渗透性及滞留性强等特点。本文将EGCG及补骨脂共同包载于脂质体中首次制备了EGCG-补骨脂脂质体(EGCG- PL)，并对其体外透皮性质进行检测。

1 材料

1.1 仪器 Waters高效液相色谱仪(1525 Binary泵、2487 UV检测器、Breeze色谱工作站，美国Waters公司)；TK-12A型 Franz扩散池(上海锴凯科技贸易有限公司)；BS110S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；JY92-II 型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)；LP 220S型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；Nano ZS90粒度仪(英国Malvern公司)；DF-101S集热式磁力加热搅拌器(金坛市医疗仪器厂)。

1.2 试药 EGCG(杭州禾田生物科技有限公司，纯度98%)；大豆卵磷脂(北京奥博星生物技术有限公司)；乙醇(大连川连酒厂)；胆固醇(广州南方化玻公司)。

2 方法

2.1 逆向蒸发法制备EGCG-PL 称取磷脂、VE及胆固醇溶解于有机溶剂中，得到有机相；EGCG和稳定剂M形成复合物的水溶液即为水相；然后将水相与有机相混合(1∶3，V/V)，进行超声分散，直至形成稳定的W/O型乳剂，40℃减压旋蒸，除去有机溶剂后，加入水化介质，在40℃水浴中旋转充分水化，然后在减压条件下继续蒸发残存的有机溶剂，随后加入3 mL补骨脂的乙醇溶液，40℃搅拌2 min， 0.22 μm微孔滤膜过滤，即得EGCG- PL。

2.2 EGCG-PL质量评价

2.2.1 EGCG-PL的外观 采用目测法，观察EGCG-PL的外观。

2.2.2 EGCG-PL的粒径及Zeta电位 取EGCG-PL适量，以水为稀释介质，用激光粒度测定仪测定EGCG-PL的粒度及其分布和Zeta电位。

2.2.3 pH值 采用PB-10型pH计对EGCG-PL的pH值进行测定。

2.2.4 超滤-HPLC测定EGCG-PL的包封率 精密量取EGCG-PL 0.4 mL置10 mL量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀，取稀释后的样品，置超滤离心管中(超滤膜截留分子量为50 KDa)，10000 rpm离心20 min，测定游离药物浓度(C游离)，另精密量取EGCG-PL 0.2 mL两份分别置10 mL的量瓶中，加一定量的甲醇后超声，其中一份加甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶2稀释至刻度，另一份加甲醇稀释至刻度，测定总药量(C)，按如下公式计算EGCG-PL中药物的包封率。包封率(%)=(C-C游离)/C×100%。

2.2.5 EGCG-PL中药物含量测定

(1)HPLC 色谱条件 色谱柱：Elite-ODS柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇∶水=40∶60；柱温：30℃；流速：1.1 mL·min-1；检测波长：246 nm；进样量：20 μL。

测定方法：精密量取0.2 mL EGCG-PL置10 mL量瓶中，加入5 mL甲醇后超声，采用甲醇稀释至刻度。取上清液过0.45 μm滤膜。精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，采用标准曲线法计算补骨脂素及异补骨脂素的含量。

(2)专属性 空白脂质体溶液：精密量取 0.2 mL不含补骨脂的空白脂质体溶液置10 mL量瓶中，按“(1)中测定方法”进行操作，精密量取续滤液20 μL，注入色谱仪，记录色谱图。

标准溶液：取“线性关系”项下5.0 μg·mL-1溶液，精密量取20 μL，注入色谱仪，记录色谱图。

供试品溶液：精密量取 0.2 mL EGCG-PL 溶液置10 mL量瓶中，按“(1)中测定方法”项下操作，精密量取续滤液20 μL，注入色谱仪，记录色谱图。

(3)线性关系 精密称取补骨脂素及异补骨脂素对照品 10.0 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；分别配制成浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0及 50.0 μg·mL-1系列标准溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以补骨脂素及异补骨脂素的峰面积A对质量浓度C进行线性回归。

(4)准确度 精密量取0.2 mL空白脂质体溶液置10 mL量瓶中，分别加入0.1 mL低、中、高三个浓度的补骨脂素及异补骨脂素标准溶液，涡旋30 s，加甲醇5 mL超声1 min后，加甲醇稀释至刻度，取上清液过0.45 μm滤膜。精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，计算低、中、高三个浓度平均回收率。

(5)精密度 取“线性关系”项下5.0 μg·mL-1溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，重复进样6次，计算峰面积的相对标准偏差(Relative Standard Deviation，RSD)值。

(6)稳定性 取供试品溶液，室温放置，分别于0 h和4 h精密量取20 μL，注入色谱仪，记录色谱峰面积，计算不同时间色谱峰面积的相对标准偏差(Relative Stanclard Deviation, RSD)值。

2.2.6 EGCG-PL的稳定性 取EGCG-PL置于西林瓶中，密封，放置在(6±2)℃下，于0 d及30 d取样，检测EGCG-PL外观、pH值、含量及包封率变化。

2.3 大鼠体外经皮渗透性及皮肤滞留量考察

2.3.1 Franz扩散装置进行体外经皮渗透性试验 将处理好的大鼠皮肤固定于供给池和接受池之间，分别取2 mL EGCG-PL及EGCG-补骨脂乙醇溶液(EGCG-PS)，置于供给池中并将其顶部密封。通过取样管向接受池中注满20%的乙醇溶液，接受液与鼠皮充分接触且无气泡。将该装置置于(32±0.5)℃恒温水浴中，磁力搅拌速度为400 r/min，分别于0.5、1、30、5、8、12、24 h取出5 mL接受液，0.45 μm微孔滤膜过滤，并立即补加同温同体积新鲜接受液，排除接受池中的气泡，采用 HPLC法测定不同时间接受液中EGCG、补骨脂素及异补骨脂素的浓度，按如下公式计算单位面积累积透过量(Q)。以时间(t)为横坐标，Q为纵坐标作图，得到药物体外经皮渗透曲线。Q=Cn校×V/A；Cn校=Cn测+Vi/V×ΣCp。式中Q为t时间单位面积累积透过量(μg/cm-2)， Cn校和Cn测分别为校正后第n次取样测得接受液中药物的浓度；V和Vi分别为接受液的总体积和每次取样体积；ΣCp为该取样点前各点的测定浓度之和；A为有效透皮扩散面积。

2.3.2 皮肤内药物滞留量试验 体外透皮试验24 h结束后，取下鼠皮，反复用20%乙醇及蒸馏水洗净皮肤表面残存药物，滤纸吸干溶剂后剪去周边的皮肤，称重，将皮肤剪碎，置于超声管中，加入5 mL甲醇，超声5 min，将上清液移入至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，过滤，取续滤液加流动相对倍稀释后，过0.45 μm 滤膜，精密量取20 μL进样，测定皮肤中滞留的药物浓度，计算单位面积皮肤中EGCG、补骨脂素及异补骨脂素的滞留量。

3 结果

3.1 EGCG-PL质量评价

3.1.1 EGCG-PL的外观 见图1。

图1 肉眼观察EGCG-PL为棕色半透明乳状液，且带明显的乳光

3.1.2 EGCG-PL粒径及Zeta电位 采用逆向蒸发法制备的EGCG-PL粒径分布均匀(图2)，平均粒径为(118.1±17.0) nm，PDI为0.20±0.07，Zeta电位为-29.3 mV，EGCG-PL所带相同电荷之间的排斥作用能有效阻止脂质体的聚集，提高EGCG-PL稳定性。

图2 EGCG-PL的粒径分布

3.1.3 pH值 本文测得EGCG-PL的pH值为5.84±0.11，有利于脂质体和药物的稳定性。

3.1.4 EGCG-PL的包封率 采用超滤-HPLC测定EGCG-PL中EGCG的平均包封率为(85.58±1.07)%，补骨脂素及异补骨脂素的平均包封率分别为(55.49±2.82)%和(53.73±1.29)%。

3.1.5 EGCG-PL中药物含量测定

(1)专属性 各样品色谱图(图3)表明，空白脂质体溶液对药物的测定无干扰，该方法具有良好的专属性。

图33a空白脂质体的液相色谱图;3b标准溶液的液相色谱图;3c EGCG-PL的液相色谱图

(2)线性关系 以补骨脂素及异补骨脂素的峰面积A对质量浓度C进行线性回归，得到补骨脂素标准曲线的回归方程为：A=101356C+6561.9，r=0.9999，异补骨脂素的回归方程为A=104590C+14208，r=0.9999，表明补骨脂素及异补骨脂素在1.0～50.0 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

(3)准确度 通过计算得到补骨脂素低、中、高三个浓度平均回收率分别为100.84%、99.78%、100.95%(n=3)，RSD分别为1.81%、1.54%、1.13%，异补骨脂素低、中、高三个浓度平均回收率分别为99.51%、100.19%、100.48%(n=3)，RSD 分别为 1.00%、0.47%、0.14%，回收率均符合要求。

(4)精密度 精密度试验结果见表1。结果表明，补骨脂素峰面积的RSD为0.89%，异补骨脂素峰面积的RSD为1.07%，表明该方法精密度符合要求。

表1 精密度试验结果

(5)稳定性 供试品溶液放置4 h补骨脂素峰面积的 RSD为0.86%，异补骨脂素峰面积的RSD为1.35%，表明供试品溶液在室温放置4 h稳定。

(6)含量测定 采用上述验证的HPLC法对所制备的三批EGCG-PL中EGCG、补骨脂素及异补骨脂素的含量进行测定。结果表明，三批样品中EGCG的含量为(1.29±0.10)mg·mL-1，补骨脂素及异补骨脂素含量分别为(223.01±16.81)μg·mL-1和 (195.13±8.46)μg·mL-1。

3.1.6 EGCG-PL的稳定性 见表2。EGCG-PL在(6±2)℃条件下放置30天后，与0天时样品相比，脂质体未见分层，三种主药包封率及含量无明显变化，说明EGCG-PL长期放置物理稳定性良好。

3.2 大鼠体外经皮渗透性及皮肤滞留量考察

3.2.1 体外经皮渗透性试验 体外经皮渗透曲线结果(图4)示：与EGCG-PS相比，EGCG-PL中EGCG、补骨脂素及异补骨脂素较易透过皮肤进入接受液中，其24 h单位面积累积透过量分别是EGCG-PS组的1.94、2.24及2.19倍。

表2 EGCG-PL稳定性

图44a:EGCG累积渗透曲线;4b:补骨脂素累积渗透曲线;4c:异补骨脂素累积渗透曲线

3.2.2 皮肤内药物滞留量试验 单位面积皮肤中EGCG、补骨脂素及异补骨脂素的滞留量结果如表3，由表可知，EGCG-PL的大鼠皮肤内EGCG、补骨脂素及异补骨脂素的滞留量要明显高于EGCG-PS组。

表3 两种EGCG制剂单位面积皮内药物滞留量

注：*P<0.05,☆P<0.001

4 讨论

EGCG是一种天然无毒的抗氧剂，通过有效抑制氧化应激产生抗白癜风的作用。然而EGCG不稳定，极易在光照、高温、碱性等条件下发生分解。本研究证实了将EGCG包载于脂质体中能够有效的提高药物稳定性，EGCG-PL在没有避光的条件下放置30 d，EGCG的含量无明显变化。而在前期的研究中发现，EGCG在光照条件下放置24 h 药物降解了16.69%。测定脂质体中药物含量需加入破膜剂溶解脂质成分，释放所包封的药物。本研究检测了Triton X-100、甲醇及乙腈三种破膜剂对脂质体中药物含量测定的影响。研究发现，Triton X-100在使用过程中容易产生泡沫，干扰定量，将样品注入液相色谱仪，出现严重拖尾，峰型很差。乙腈破膜提取时，样品回收率较低。选择甲醇作为破膜溶剂时，样品回收率符合要求，峰型较好且分析时间适宜，因此，本文最终选用甲醇作为破膜溶剂。体外经皮渗透性试验结果显示，EGCG-PL中EGCG、补骨脂素及异补骨脂素的累积透过量及皮肤滞留量要显著大于EGCG-PS组，这是由于脂质体的纳米结构能够使其紧密的黏附在角质层，形成连贯的具有闭塞效应膜，增加皮肤水合作用，减少水分散失从而提高药物渗透性；同时脂质体类似于表皮的结构，能进一步提高药物渗透性；两种制剂的皮肤滞留量研究发现，EGCG-PL较EGCG-PS能显著提高EGCG、补骨脂素及异补骨脂素在皮肤中的滞留量。