樟子松乙醇提取物体外抗氧化活性研究

张力凡 薛 煜 王 岩 杨光鑫 杨 光 邸雪颖*

(1.东北林业大学林学院，哈尔滨 150040； 2.黑龙江省黑河市逊克县道干林场，黑河 164499； 3.国家林业局大兴安岭林业调查规划设计院，加格达奇 165000)

松科植物体内含有许多化合物，其中有一些生物活性成分，还有一些的酚类化合物。现今，科学技术和科研条件不断发展，越来越多对松科树种，如偃松(Pinuspumila)、落叶松(Larixgmelinii)、马尾松(PinusmassonianaLamb)等的生物活性成分研究不断开展。

樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)属松科(Pinaceae)松属(Pinus)，是特别耐寒的常绿乔木，且耐旱，能在特别贫瘠的土壤上生长，是我国重要的造林树种之一[1]。松科植物的体内含有许多化合物，其中，多酚类化合物所占比重较大，多酚类化合物的生物活性和化学性质比较独特，被称为松多酚[2]。目前，国内外深入研究了植物中多酚类化合物的多种生理功能[3]。发现机体中的游离的自由基和氧化反应是导致老年痴呆症、关节炎、肿瘤、动脉粥样硬化、帕金森氏病等疾病的原因之一[4～5]。为了预防这些疾病的产生，可以利用天然抗氧化剂植物的多酚类化合物均衡机体自由基的数量，并且将氧化进程抑制或者中断[6]。Pinelo等人提取了松木屑的提取物，并从中分离出了大量具有较强抗氧化能力的酚类物质[7]。除此之外，松科植物中含有自由基清除剂的部位还有种壳提取物、树皮、球果等[8～9]。Taner的研究结果说明松科树种的树皮提取物能避免淋巴细胞受到过氧化氢诱导的基因损伤[10]。

类黄酮拥有自由基清除活性功能和抗氧化功能，是一大类从高等植物体内提取的可食用的多酚类物质，对人类有着医疗营养价值，主要功能有保护心血管系统、抗癌、保护神经系统、抗病毒等[11]。类黄酮可以影响基因的表达，也可以调节细胞信号传导途径。这是在研究类黄酮生物体内生物活性和体外生物活性的进展中，又出现的一种新的观点[12～13]。

1 实验材料与方法

1.1 材料及预处理

在大兴安岭加格达奇地区选取树龄约为20年，立地条件相同并且长势良好的樟子松3株，分别采集树皮、树叶、木质部和球果，带回实验室后于50℃烘干至恒重，粉碎并过80目筛后密封并置于-20℃冰箱保存。

1.2 仪器与药品

试剂：1 mol·L-1福林酚溶液、无水乙醇、硫酸亚铁溶液、过氧化氢溶液、水杨酸溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸钠溶液、铁氰化钾溶液、三氯乙酸、三氯化铁溶液、Tris-HCl缓冲液、邻苯三酚溶液。

所用试剂盒均购自南京建成生物研究所；上海源叶生物科技有限公司购进的芦丁标准品；其他试剂均为国产分析纯。

仪器：分析天平(感应量0.1 mg)；Gene Quant 1300型分光光度计。

1.3 实验方法

1.3.1 多酚提取

以65℃为提取温度，料液比1∶50 g∶mL，提取时间为1 h，提取液乙醇溶液体积分数为60%。并采用频率40 kHz、功率250 W的超声波辅助提取。

1.3.2 总酚测定

总酚含量测定使用福林一肖卡法，参照Singleton et al.1999的方法测定。取10 mL试管，依次加入0.1 mL果实提取液，7.9 mL蒸馏水，摇匀后加0.5 mL福林酚试剂(使用前需按1∶1稀释)，充分摇匀，5 min之后加入20%的饱和Na2CO3溶液1.5 mL，混匀，避光反应2 h，以提取溶剂为对照，用分光光度计在765 nm波长下比色，测定吸光度，每个处理重复3次，结果以没食子酸等价值(mg/100 g FW)表示。没食子酸标准溶液浓度为：50、100、200、400、600、800、1 000 mg·L-1。以吸光值A为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标，绘制标准曲线,总酚浓度标准曲线(图1)，所得回归方程为y=0.562x+0.032 4，R2=0.995 7。

1.3.3 总黄酮测定

精密称取芦丁标准品10 mg，采用体积分数为60%的乙醇溶液配制成50 mL浓度为0.2 mg·mL-1的芦丁标准溶液。取上述标准溶液稀释到浓度为0，0.02，0.04，0.06…0.2 mg·mL-1的芦丁溶液，(芦丁标准溶液体积分别为0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 mL)分别吸取5 mL上述各浓度芦丁溶液，置于0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10号共11支25 mL容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠(NaNO2)溶液1.0 mL，充分混匀，置于室温下静置6 min；再分别加入10%硝酸铝(Al(NO3)3)溶液1.0 mL，充分混匀，置于室温下静置6 min；接着再加入5 mL浓度为1 mol·L-1氢氧化钠(NaOH)溶液，最后用75%乙醇溶液定容至25 mL，显色15 min后在510 nm波长处测定吸光值，以吸光值A为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线。

不同浓度芦丁标准品溶液按本步骤进行操作后，在波长510 nm处测定各质量浓度的吸光值A，以芦丁标准品质量浓度(mg·mL-1)为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘出标准曲线(图2)。总黄酮浓度标准曲线回归方程为y=2.561 7x-0.001，R2=0.999 5。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Gallic acid standard curve

图2 芦丁标准曲线Fig.2 Rutin standard curve

1.3.4 DPPH自由基(DPPH·)清除率测定

用95%乙醇溶液配置DPPH浓度为0.2 mmol·L-1的乙醇溶液。避光置于冰箱中冷藏备用。测定方法：在2 mL DPPH乙醇溶液中加入2 mL样品溶液，对照管用95%乙醇代替DPPH溶液；空白管用蒸馏水代替多糖溶液。混匀器混匀后避光反应30 min。波长调至517 nm处用0.5 mL蒸馏水和2.5 mL 95%的乙醇调零，测定反应液吸光值，每个浓度设置3个平行实验，结果取平均值。DPPH·自由基的清除率用下面的公式表示。以抗坏血酸VC做阳性对照，用以评价樟子松多酚对DPPH·的清除能力。

(1)

式中：C为清除率；A0为2mL DPPH乙醇溶液+2 mL超纯水的吸光值；A1为2 mL DPPH乙醇溶液+2 mL样品溶液后的吸光值；A2为2 mL样品溶液+2 mL超纯水的吸光值。

1.3.5 总还原力的测定

用蒸馏水将多糖溶液稀释至所需浓度，向试管中分别加入各浓度多糖溶液1.0 mL，0.2 mol·L-1的pH6.6的磷酸缓冲溶液2.5 mL，快速混匀后加入质量分数为1%的铁氰化钾溶液2.5 mL然后置于50℃水浴20 min。迅速冷却反应液并加入体积分数为10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，充分混匀，在3 000 r·min-1条件下离心10 min。取上清液3 mL，依次加入3 mL蒸馏水和1.0 mL的0.1%的三氯化铁溶液，充分混匀后静置10 min，在700 nm波长下测定溶液吸光度。吸光度越大还原能力也越大。以VC做阳性对照，用以评价总还原能力。

还原力=A样品-A空白

(2)

使用购自南京建成生物研究所的专业试剂盒进行测定，各个步骤均严格按照试剂盒内的说明书进行。

2 结果与分析

2.1 各部位多酚与黄酮含量分析比较

樟子松各部位多酚与总黄酮含量如图3所示，从图3中可以看出从樟子松木质部提取的多酚浓度和黄酮浓度都与其他3个部位相差巨大，故不继续测定5个抗氧化指标。就樟子松树皮、树叶球果3个部位而言，樟子松树皮中松多酚的含量最高，为82 mg·g-1左右；其次为樟子松球果中的松多酚含量，为60 mg·g-1左右；樟子松树叶中的松多酚含量最低，为44 mg·g-1左右。仅在多酚含量这一指标上，樟子松树皮中的多酚含量就将近樟子松树叶中多酚含量的2倍。在总黄酮含量上，仍然是从樟子松树皮中提取到的总黄酮含量最大，为11 mg·g-1左右；其次为从樟子松树叶中提取的总黄酮，含量为9 mg·g-1左右；从樟子松球果中提取的总黄酮含量最低，仅为5 mg·g-1左右。根据从樟子松各个部位的多酚和总黄酮含量计算出总黄酮占多酚类物质的百分比，进行比较，结果为樟子松树叶中总黄酮类物质占多酚类物质的比例最高，为20%；其次为樟子松树皮中总黄酮类物质占多酚类物质的13%；樟子松球果中总黄酮类物质占多酚类物质的比例最低，仅为8%。根据图4分析，从樟子松树皮、树叶、球果3个部位提取出来的多酚和黄酮类物质的含量大小并没有明显规律，虽然樟子松树叶中的多酚和总黄酮含量都不是3个部位中最高的，但黄酮类物质占多酚的比重却是最高的；而樟子松球果中的黄酮类物质的含量虽然为比樟子松树叶中的黄酮类物质含量低，但多酚含量却大于樟子松树叶中的；樟子松树皮中的多酚和总黄酮含量均为三者当中最高的，因此樟子松树皮是目前樟子松多酚的主要来源。

图3 各部位多酚与黄酮含量比较Fig.3 Comparison of the content of polyphenol and flavone in different parts

图4 各部位总黄酮占多酚比例Fig.4 The proportion of total flavonoids in various parts to polyphenols

2.2 DPPH·自由基(DPPH·)清除能力的比较

按照DPPH·自由基清除能力测定方法，从而得出樟子松树皮、树叶、球果3个部位提取出的松多酚在各个浓度下的DPPH·自由基清除率(图5)。

图5 DPPH·自由基清除能力Fig.5 DPPH· free radical scavenging capacity

如图5所示，抗氧化剂VC在各个浓度的DPPH自由基(DPPH·)清除率均高于从樟子松树皮、树叶、球果3个部位提取的松多酚DPPH自由基(DPPH·)清除率，差距最大在浓度为0.064 mg·mL-1左右，抗氧化剂VC的DPPH自由基(DPPH·)清除率约为树叶和球果的2倍、树皮的1.5倍。

就樟子松树皮、树叶、球果3个部位的樟子松多酚而言，3条曲线均呈现在较低浓(0.03～0.1 mg·mL-1)时(DPPH·)清除率随浓度的升高增大趋势较快；随着浓度的增大(大于0.1 mg·mL-1)，DPPH·清除率逐渐趋于稳定。抗氧化剂VC在浓度0.032～0.064范围内DPPH·自由基清除率随着浓度升高而增长显著，当浓度大于0.064 mg·mL-1后呈稳定趋势，稳定在90%左右。而在各个浓度下，3个部位的樟子松多酚DPPH·自由基(DPPH·)清除率均呈现出树皮提取出的最大，树叶提取出的第二，球果提取出的的最小。此DPPH·自由基(DPPH·)清除率结果证实了上文的初步结论，即从樟子松3个部位提取的松多酚体外抗氧化能力为树皮>树叶>球果。

2.3 超氧阴离子清除能力的比较

图6 超氧阴离子清除率Fig.6 Superoxide anion clearance rate

2.4 总抗氧化能力的比较

测得结果如图7所示，总抗氧化能力指标差异较大，仍然是抗氧化剂VC在各个浓度下的抗氧化能力均高于从樟子松3个部位提取出的多酚。抗氧化剂VC的总抗氧化能力依然在较低浓度(0.032～0.064 mg·mL-1)下随浓度的增加变化较大，由0.032 mg·mL-1的44.06%增加到0.064 mg·mL-1的70.16%。最大值在VC浓度为0.16 mg·mL-1时，总抗氧化能力为93.72%。树皮、树叶、球果3个部位的樟子松多酚抗氧化能力比较如下：树叶中提取到的樟子松多酚抗氧化能力在各个浓度下均为最小的；浓度在0.05 mg·mL-1以下时树皮中多酚的抗氧化能力为三者中最高的，浓度在0.05 mg·mL-1左右时球果的抗氧化能力与树皮的抗氧化能力重合，而当浓度大于0.05 mg·mL-1时，从球果中提取到的多酚抗氧化能力为三者当中最大的，在浓度为0.032 6～0.097 8 mg·mL-1范围内时，从球果中提取到的多酚抗氧化能力随浓度的增大呈现急剧增长趋势，从0.032 6 mg·mL-1时的8.33%增长到0.097 8 mg·mL-1的70.69%，最大值为0.163 mg·mL-1时的84.104%， 只与抗氧化剂VC的最大值相差10%左右。而从树皮中提取到的樟子松多酚抗氧化能力最大值在浓度为0.165 7 mg·mL-1时的72.41%，从树叶中提取到的樟子松多酚抗氧化能力最大值在浓度为0.176 26 mg·mL-1时的56.69%。结合图3中樟子松3个部位多酚与黄酮含量对比分析，虽然樟子松球果中多酚和黄酮的浓度都不是最高的，但却具有三者中最大的抗氧化能力，说明樟子松球果中的松多酚具有很强的抗氧化能力；樟子松树皮中的多酚和黄酮浓度均高于樟子松树叶中的多酚与黄酮浓度，因此从樟子松树皮中提取的松多酚抗氧化能力要高于从樟子松树叶。

图7 总抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity

2.5 羟自由基(·OH)清除能力的比较

羟自由基(·OH)是一种很强的氧化剂，几乎可与活细胞中的任何生物分子发生反应造成机体损伤，并且反应速度极快。因此，研究羟自由基(·OH)的清除剂对研究某些病变原因、衰老机理的揭示具有重大意义。

如图8所示，羟自由基(·OH)清除率指标四条曲线相差非常小，但羟自由基清除率最大值也不超过40%，说明羟自由基(·OH)清除难度较其他自由基大。从樟子松树皮、树叶、球果3个部位提取出的樟子松多酚羟自由基(·OH)清除能力只有微小差异，三者在同一浓度下的羟自由基(·OH)清除率大小关系为树皮>树叶>球果，这与图2中3个部位中总黄酮的浓度大小关系相对应，说明影响羟自由基(·OH)清除率的主要因素为黄酮类物质的浓度大小，黄酮类物质浓度越大，羟自由基(·OH)清除率越高。其中从树皮中提取的樟子松多酚在最高浓度0.165 7 mg·mL-1处的羟自由基(·OH)清除率最高，为37.21%，超过了抗氧化剂VC在最高浓度0.16mg·mL-1处的36.71%，具有较强的羟自由基(·OH)清除能力。

图8 羟自由基(·OH)清除能力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging capacity

图9 总还原力Fig.9 The total reducing power

2.6 总还原力的比较

还原力的大小是评价一种物质抗氧化能力高低的一种重要指标，其原理为Fe3+被具有较强还原力的物质还原成Fe2+，Fe2+在酸性条件下可以和Fe2Cl3生成有颜色的普鲁士蓝，普鲁士蓝在700 nm波长下有大吸收峰，因此多酚化合物的抗氧化性越强，其吸光度越大。

如图9所示，总还原力指标中，从樟子松球果中提取到的樟子松多酚的还原能力最高，在各个浓度下均高于抗氧化剂VC、从树皮中提取的樟子松多酚、从树叶中提取的樟子松多酚的还原能力。在浓度为0.163 mg·mL-1时达到最大值1.90，高于抗氧化剂VC浓度为0.16 mg·mL-1时的1.503。从树皮中提取的樟子松多酚的还原能力在浓度0.08 mg·mL-1左右与抗氧化剂VC的还原能力相当，在此之后随着浓度的增加，从樟子松树皮中提取的樟子松多酚的还原能力增长趋势较抗氧化剂VC的小。而从樟子松树叶中提取的樟子松多酚的还原能力在各个浓度下都是四者当中最弱的，最大值仅为浓度0.176 26 mg·mL-1时的0.614，仅为抗氧化剂VC的一半。结合图2分析，虽然从樟子松球果中提取到的樟子松多酚浓度和总黄酮浓度都不是最高的，但却具有最强的还原能力，说明从樟子松球果中提取到的樟子松多酚具有较强的抗氧化活性；而从樟子松树皮中提取的樟子松多酚浓度和总黄酮浓度均高于从樟子松树叶中提取到的；而从樟子松树叶中提取的多酚浓度仅为44 mg·g-1左右，为三者当中最低的，从而决定了总还原力指标是三者当中最小的。

3 结论

通过本实验再次证明了樟子松多酚具有极强的抗氧化能力，是自然界存在的天然抗氧化剂，尤其是樟子松树皮中提取的多酚。而目前国内植物多酚的主要来源渠道为茶叶、水果、各种谷物以及一些常见的坚果，樟子松多酚的开发利用尚处于起步阶段，发展前景非常广阔，相信樟子松多酚的开发利用能够大大改善这一局面，为植物多酚的来源渠道提供更多、更好的选择。希望本实验能够为樟子松资源的开发利用提供理论基础，充分发挥樟子松多酚在药用、食品、保健、化妆品等领域的优良作用。