崇左金花茶花朵和叶片类黄酮UPLC-Q-TOF-MS分析

李辛雷 王佳童, 孙振元 王 洁 殷恒福 范正琪 李纪元

(1.中国林业科学研究院亚热带林业研究所，杭州 311400； 2.林木遗传育种国家重点实验室，中国林业科学研究院林业研究所，北京 100091)

山茶属(Camellia)金花茶组(Section Chrysantha Chang)植物有30多种[1]，其花朵和叶片中多含有类黄酮、多糖、多酚及皂苷等活性成分，具有降血糖、降血脂和抗肿瘤、抗抑郁症等药理功效[2～5]。目前，利用金花茶(C.nitidissima)花朵和叶片开发的片剂、粉剂和浓缩液等产品已投放市场[1]。对金花茶类植物活性成分的研究有利于开发其药用食用价值，提高其经济附加值，但目前相关研究多集中于类黄酮、多糖等总量分析方面[3～4]，类黄酮组分的鉴定主要集中在金花茶等少数物种上，如对金花茶花朵化学成分的研究表明，其花中含有槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷等类黄酮成分[6～7]，但其花朵、叶片中类黄酮等活性成分含量及其变化特征尚不清楚，此外，大多数金花茶组植物类黄酮成分的研究工作尚未涉及，因此，极大地限制了金花茶组植物类黄酮等活性成分的开发利用。

崇左金花茶(C.chuangtsoensis)为山茶属金花茶组植物，不同于其他金花茶组物种，崇左金花茶花期较长，其盛花期为6～8月，但在适宜栽培条件下，一年四季都可以开花，被称为四季金花茶[8]，因此，有望为金花茶类花朵活性成分的开发持续提供原材料。崇左金花茶花色深黄色，含有类黄酮等活性成分[1]，是提取金花茶植物类黄酮成分的优良材料，可用于开发金花茶类黄酮药品及食品等，但目前关于崇左金花茶的研究主要集中于栽培[9]、氨基酸成分[10]及遗传标记开发[11]等方面，而关于其类黄酮成分含量及其变化特征尚不清楚。不同于紫外—可见分光光度法和高效液相色谱法，超高效液相色谱—四极杆—飞行时间质谱联用技术可提供谱峰的光谱和质谱信息，即使没有标准化合物，通过分析质谱信息及对比文献数据也可以鉴定各组分，并通过标准品进行含量分析[12]。鉴于此，本试验利用超高效液相色谱—四极杆—飞行时间质谱联用技术对崇左金花茶花朵(花瓣、雄蕊)和叶片(老叶、新叶)中类黄酮成分及其含量进行分析，研究崇左金花茶类黄酮成分的变化规律，以期为崇左金花茶资源的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为崇左金花茶盛开期花朵(花瓣、雄蕊)和老叶、新叶(图1)，所有材料均来源于中国林业科学研究院亚热带林业研究所山茶种质资源库。选取生长状况一致的崇左金花茶5株，每株采摘树冠外围南面枝条上老叶、当年生新叶及盛开期花朵各3朵。

1.2 试剂

标准品槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、山柰酚、山柰酚-3-O-葡萄苷、木犀草素、圣草素和芸香柚皮苷购于Sigma公司，纯度≥98%；儿茶素和表儿茶素购于北京索莱宝科技有限公司，纯度≥98%。

1.3 仪器与设备

ACQUITYTM UPLC I-Class超高效液相色谱系统(Waters Corporation，Milford，MA，USA)，Xevo G2-XS QTof MS质谱系统(Waters Corporation，Manchester，UK)，UNIFI 1.8软件系统；Milli-Q-Gradient超纯水制备系统。

图1 崇左金花茶花朵和叶片 A.花朵；B.老叶；C.新叶Fig.1 Flower and leave of C.chuangtsoensis A.Flower; B.Old leaf; C.New leaf

1.4 方法

1.4.1 定性分析

崇左金花茶新鲜花瓣、雄蕊、老叶和新叶各0.6 g，液氮研磨成粉末，加甲醇∶水∶甲酸∶THF(70∶27∶2∶1，体积比)提取溶剂2 mL浸提[13]，24 h后依次用滤纸及0.22 μm滤膜过滤，滤液保存在-20℃冰箱备用[14]。

利用超高效液相色谱—四极杆—飞行时间质谱联用技术对花瓣、雄蕊、老叶和新叶中类黄酮成分进行定性与定量分析。色谱柱为ACQUITY BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，以0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)为流动相，流速0.3 mL·min-1；洗脱程序为0～1.5 min，5% B；1.5～11 min，5%～40% B；11～14 min，40%～95% B；14～16.5 min，95% B；16.5～16.8 min，95%～5% B；16.8～20 min，5% B。每次进样量为2 μL，柱温40℃，自动进样器温度维持在4℃。电喷雾电离离子源(ESI)，准确质量数用亮氨酸脑啡肽作校正液。离子化模式为正离子，离子源温度为120℃，脱溶剂气体为高纯度氮气，温度为450℃，流速为600 L·h-1，毛细管电压为1 kV，锥孔电压为40 V，扫描范围为50～1 200 m/z。低能量扫描时电压为6 eV，高能量扫描时电压为20～45 eV。数据采集模式为Continuum模式。

1.4.2 定量分析

建立儿茶素、表儿茶素、槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、山柰酚和山柰酚-3-O-葡萄糖苷等7种类黄酮标准曲线进行定量计算(表1)。对无标准品或无标准曲线的类黄酮成分，参考张维冰等[12]方法，以崇左金花茶中含量较高的类黄酮成分槲皮素-3-O-葡萄糖苷标准品为基准进行相对定量，其公式为：

Ci,j=(Ai,j/Ai)·(Mi,j/Mi)·Ci

(1)

式中：i表示标准品；j表示利用标准品i定量的其他成分；C表示含量；A表示色谱峰面积；M表示化合物的平均分子量。

试验重复5次，计算各成分含量。

表1 7种类黄酮标准曲线

2 结果与分析

2.1 崇左金花茶花朵和叶片类黄酮鉴定

利用UPLC-Q-TOF-MS对崇左金花茶花朵和叶片中类黄酮成分进行定性分析，根据UPLC-Q-TOF-MS和MS图谱，参考相关文献，对其主要成分进行结构鉴定，共检测到14种类黄酮成分(图2)，其质谱数据见表2。14种类黄酮成分中，除成分C3、C4和C12外，其余11种成分均有标准品作为对照。比对标准品，C1和C2分别为儿茶素和表儿茶素。无标准品对照的C3质谱数据为分子离子m/z 595.17，特征碎片离子m/z 287.06，与张维冰等[12]鉴定木犀草素-7-O-芸香糖苷结果相同，推定其为木犀草素7-O-芸香糖苷；C7质谱数据为分子离子m/z 287.06，特征碎片离子m/z 153.02，根据标准品对照判断其为木犀草素。

表2 崇左金花茶类黄酮质谱数据

Table 2 UPLC-Q-TOF-MS data of flavonoids ofC.chuangtsoensis

成分No. components保留时间Retention time(min)分子离子(m/z)Molecular ions碎片离子(m/z)Fragment ions类黄酮鉴定Flavonoids identificationC13.56291.09247.06儿茶素∗CatechinC24.51291.09163.03表儿茶素∗EpicatechinC34.72595.17287.06木犀草素-7-O-芸香糖苷Luteolin-7-O-rutinosideC45.13627.16303.05槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷Quercetin-3,7-O-diglucosideC55.77611.16303.05槲皮素-3-O-芸香糖苷∗Quercetin-3-O-rutinosideC65.93465.11303.05槲皮素-3-O-葡萄糖苷∗Quercetin-3-O-glucosideC76.07287.06153.02木犀草素∗LuteolinC86.40289.08153.02圣草素∗EriodictyolC96.54449.11287.06山柰酚-3-O-葡萄糖苷∗Kempferol-3-O-glucosideC106.63581.19427.10芸香柚皮苷∗NarirutinC116.77465.10303.05槲皮素-7-O-葡萄糖苷∗Quercetin-7-O-glucosideC126.80433.11271.06染料木苷GenistinC137.08303.05289.07槲皮素∗QuercetinC149.39287.06153.02山柰酚∗Kaempferol

注：*为有标准品对照的成分。

Note:*represent the standard control compounds.

图2 崇左金花茶类黄酮成分HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogram of flavonoid components of C.chuangtsoensis

图3 崇左金花茶花朵和叶片类黄酮成分含量(μg·g-1)C1.儿茶素;C2.表儿茶素;C3.木犀草素-7-O-芸香糖苷;C4.槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷;C5.槲皮素-3-O-芸香糖苷;C6.槲皮素-3-O-葡萄糖苷;C7.木犀草素;C8.圣草素;C9.山柰酚-3-O-葡萄糖苷;C10.芸香柚皮苷;C11.槲皮素-7-O-葡萄糖苷;C12.染料木苷;C13.槲皮素;C14.山柰酚Fig.3 Contents offlavonoidcomponents in flowers and leaves of C.chuangtsoensis C1.Catechin; C2.Epicatechin; C3.Luteolin-7-O-rutinoside; C4.Quercetin-3,7-O-diglucoside; C5.Quercetin-3-O-rutinoside; C6.Quercetin-3-O-glucoside; C7.Luteolin; C8.Eriodictyol; C9.Kempferol-3-O-glucoside; C10.Narirutin; C11.Quercetin-7-O-glucoside; C12.Genistin; C13.Quercetin; C14.Kaempferol

无标准品对照的C4质谱数据为分子离子m/z 627.16，特征碎片离子m/z 303.05，与Ceska和Styles[15]鉴定槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷结果相同，推定其为槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷；具有标准品对照的C5、C6、C11和C13分别为槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷和槲皮素。具标准品对照的C9和C14为山萘酚-3-O-葡萄糖苷和山柰酚，C8和C10为圣草素和芸香柚皮苷；无标准品的C12质谱数据为分子离子m/z 433.11，特征碎片离子为m/z 271.06，与李蓓佳等[16]鉴定染料木苷结果相同，推定其为染料木苷。

2.2 崇左金花茶花朵和叶片类黄酮成分含量

崇左金花茶花朵和叶片中类黄酮成分含量见图3，崇左金花茶雄蕊中儿茶素、表儿茶素含量均远高于花瓣、叶片，花瓣中儿茶素含量远高于叶片。雄蕊中木犀草素、木犀草素-7-O-芸香糖苷含量均远高于花瓣、叶片，花瓣中木犀草素含量远高于叶片而木犀草素-7-O-芸香糖苷含量高于老叶但低于新叶。花瓣和雄蕊中槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖苷等5种类黄酮含量均远高于老叶和新叶，且花瓣中相应含量均高于雄蕊，分别是雄蕊的1.74、1.35、3.09、4.21和1.74倍。芸香柚皮苷、圣草素和燃料木苷主要存在于花朵中，且芸香柚皮苷和圣草素在雄蕊中含量远高于花瓣，燃料木苷在花瓣中含量远高于雄蕊。

崇左金花茶花朵和叶片中类黄酮成分比例见表3，花瓣中类黄酮成分含量较高的依次为槲皮素-3-O-葡萄糖苷、表儿茶素和木犀草素，分别占其类黄酮总量的26.06%、23.91%和11.25%，合计61.23%；其次为槲皮素-7-O-葡萄糖苷，占9.00%。雄蕊中类黄酮含量较高的依次为表儿茶素、木犀草素和槲皮素-3-O-葡萄糖苷，分别占其类黄酮总量的37.28%、17.73%和11.44%，合计66.45%；其次为儿茶素，占10.25%。老叶中含量较高的为表儿茶素、木犀草素和木犀草素-7-O-芸香糖苷，分别占其类黄酮总量的76.25%、11.37%和6.19%，合计93.81%；其次为槲皮素-3-O-葡萄糖苷，占2.21%。新叶中含量较高的为表儿茶素、木犀草素-7-O-芸香糖苷和木犀草素，分别占64.85%、12.34%和10.35%，合计87.54%；其次为槲皮素-3-O-葡萄糖苷，占4.68%。可见，崇左金花茶花朵中含量较高的类黄酮成分主要是表儿茶素、木犀草素和槲皮素-3-O-葡萄糖苷，叶片中主要是表儿茶素、木犀草素和木犀草素-7-O-芸香糖苷。

2.3 崇左金花茶花朵和叶片类黄酮分类

崇左金花茶中类黄酮成分主要为儿茶素类、木犀草素类、槲皮素类、山萘酚类和其他类型(表4)。花瓣中含量较高的依次为槲皮素类、儿茶素类和木犀草素类，分别占其类黄酮总量的47.25%、30.91%和14.29%，合计92.45%。雄蕊中含量较高的依次为儿茶素类、木犀草素类和槲皮素类，分别占类黄酮总量的47.53%、26.15%和18.33%，合计92.01%。老叶和新叶中儿茶素类含量均最高，分别占其类黄酮总量的77.81%和68.05%；其次为木犀草素类，分别占其类黄酮总量的17.56%和22.69%；儿茶素类和木犀草素类合计占老叶和新叶类黄酮总量的95.37%和90.74%。可见，崇左金花茶花朵中类黄酮成分类型主要为儿茶素类、木犀草素类和槲皮素类，叶片中主要为儿茶素类和木犀草素类。

表3 崇左金花茶花朵和叶片类黄酮成分比例(%)

Table 3 Proportions off lavonoid components in flowers and leaves ofC.chuangtsoensis

类黄酮Flavonoids花瓣Petals雄蕊Stamens老叶Old leaves新叶New leaves儿茶素Catechin7.0010.251.563.20表儿茶素Epicatechin23.9137.2876.2564.85木犀草素Luteolin11.2517.7311.3710.35木犀草素-7-O-芸香糖苷Luteolin-7-O-rutinosid3.048.426.1912.34槲皮素Quercetin0.010.000.670.73槲皮素-3-O-葡萄糖苷Quercetin-3-O-glucoside26.0611.442.214.68槲皮素-3-O-芸香糖苷Quercetin-3-O-rutinoside6.363.611.272.91槲皮素-7-O-葡萄糖苷Quercetin-7-O-glucoside9.002.220.030.12槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷Quercetin-3,7-O-diglucoside5.811.06——山柰酚Kempferol0.110.080.020.14山柰酚-3-O-葡萄糖苷Kempferol-3-O-glucoside2.591.140.080.39芸香柚皮苷Narirutin1.231.900.010.00圣草素Eriodictyol2.994.690.020.08染料木苷Genistin0.640.180.300.21

注：“—”表示未鉴定出。

Note:“—” not identified.

表4 崇左金花茶花朵和叶片类黄酮分类(μg·g-1)

崇左金花茶花瓣和雄蕊中类黄酮总量分别为555.77和727.59 μg·g-1，两者远高于老叶的209.01 μg·g-1和新叶的227.85 μg·g-1；花瓣中类黄酮总量分别为老叶和新叶的2.66和2.44倍，雄蕊中类黄酮总量分别为老叶和新叶的3.48和3.19倍。儿茶素类在雄蕊中含量最高，分别为花瓣、老叶和新叶的2.01、2.13和2.23倍。木犀草素类在雄蕊中含量最高，分别为花瓣、老叶和新叶的的2.40、5.19和3.68倍；花瓣中木犀草素类含量为老叶的2.16和1.54倍。槲皮素类在花瓣中含量最高，分别为雄蕊、老叶和新叶的1.97、29.98和13.66倍；雄蕊中槲皮素类含量分别为老叶的15.22和6.94倍。花瓣、雄蕊中山萘酚类和其他成分含量远高于叶片，且花瓣中山萘酚类含量高于雄蕊。可见，崇左金花茶花瓣和雄蕊中儿茶素类、木犀草素类及类黄酮总量均高于叶片，且雄蕊高于花瓣；花瓣和雄蕊中槲皮素类远高于叶片，且花瓣中远高于雄蕊。

3 讨论

本试验利用超高效液相色谱—四极杆—飞行时间质谱联用技术对崇左金花茶花朵和叶片进行定性定量分析，共检测到14种类黄酮成分，其中儿茶素类2种、槲皮素类5种、山萘酚类2种、木犀草素类2种、芸香柚皮苷等其他成分3种。在对类黄酮成分定量分析时，张维冰等[12]利用超高效液相色谱-二级管阵列检测-串联质谱法对菊花(Dendranthemamorifolium)中多酚类物质的研究表明，由于缺乏所有化合物的标准品，在定量分析中可选取几种在菊花中含量较高的组分为标准进行定量分析，而其他多酚类物质以其为基准进行相对定量。本试验在定量分析时利用已有标准样品建立了7种标准曲线，对无标准品或无标准曲线的类黄酮成分，参考张维冰等[12]方法，以崇左金花茶中含量较高的类黄酮成分槲皮素-3-O-葡萄糖苷标准品为基准，利用公式Ci,j=(Ai,j/Ai)·(Mi,j/Mi)·Ci进行相对定量，试验重复5次，计算各成分含量。结果表明，各成分含量均在标准曲线的线性范围内，R2达0.999以上，说明本试验建立的类黄酮成分定量分析方法能有效定量各成分含量。

本试验检测到的14种类黄酮成分中木犀草素、木犀草素-7-O-芸香糖苷、槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷、芸香柚皮苷、圣草素和染料木苷等6种类黄酮成分均为金花茶组植物中首次发现，且木犀草素、木犀草素-7-O-芸香糖苷在花朵和叶片中含量均较高，而槲皮素-3,7-O-二葡萄糖苷、芸香柚皮苷、圣草素和染料木苷等主要存在于花朵中。崇左金花茶中槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖苷是金花茶花瓣中主要类黄酮成分[7,17]，但其在崇左金花茶叶片中的发现为首次报道[3]。崇左金花茶花朵和叶片中儿茶素类成分仅检测到儿茶素和表儿茶素，且以表儿茶素为主。

本试验中崇左金花茶花朵类黄酮含量远高于叶片，花瓣中含量较高的依次为槲皮素类、儿茶素类和木犀草素类，雄蕊中含量较高的依次为儿茶素类、木犀草素类和槲皮素类，老叶和新叶中儿茶素类含量分别占类黄酮总量的77.81%和68.05%，而槲皮素类、木犀草素类等含量相对较低，这可能主要与类黄酮的合成途径相关，槲皮素类、木犀草素类前体通过还原酶合成儿茶素，导致叶片中槲皮素类、木犀草素类含量降低具体原因有待于进一步研究。新叶中木犀草素类、槲皮素类和山萘酚类含量明显高于老叶，可能主要由于新叶为生长活跃区域，次生代谢旺盛，导致类黄酮等次生代谢产物增加，具体原因有待于进一步研究。

已有研究认为，矢车菊素类花青苷是红色山茶花瓣中主要的花青苷成分[18～20]，而槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷等类黄酮是金花茶类花朵呈现黄色的主要原因[21～22]。本试验崇左金花茶花瓣中儿茶素类含量约为雄蕊一半但和叶片相差不大，且儿茶素类占花瓣类黄酮30.91%；而花瓣中槲皮素类含量约为雄蕊两倍但远大于叶片，且槲皮素类占花瓣类黄酮47.25%，尤其槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷等含量较高，说明槲皮素类为崇左金花茶花瓣呈现黄色的主要原因，这与前人对金花茶研究结果一致[21～22]。

研究表明，植物中类黄酮成分具有生物活性，可用于消炎、杀菌、增强心脑血管和抗肿瘤等方面[3,23～24]。崇左金花茶花期长、花量多，原料丰富，花朵和叶片中含有槲皮素类、儿茶素类等类黄酮成分，研究认为相关类黄酮成分具有抑制肿瘤、降“三高”、抗氧化、增强心血管和人体免疫力等生理功效[3,25～26]，因此，崇左金花茶中类黄酮具有广泛应用前景，是开发金花茶类黄酮的良好材料，可用于医药、保健及食品等。本试验利用超高效液相色谱—四极杆—飞行时间质谱联用技术对崇左金花茶中主要类黄酮成分进行了研究，明确了崇左金花茶花朵和叶片中类黄酮成分、含量及其变化特征，为进一步开发利用提供了科学依据。

崇左金花茶花朵中含量较高的类黄酮为儿茶素类、木犀草素类和槲皮素类，主要是表儿茶素、木犀草素和槲皮素-3-O-葡萄糖苷；叶片中为儿茶素类和木犀草素类，主要是表儿茶素、木犀草素和木犀草素-7-O-芸香糖苷。崇左金花茶花瓣和雄蕊中儿茶素类、木犀草素类及类黄酮总量高于叶片，且雄蕊高于花瓣；花瓣和雄蕊中槲皮素类远高于叶片，且花瓣中远高于雄蕊。槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷等为崇左金花茶花瓣呈现黄色的主要原因。