双龙方对离体大鼠冠状动脉舒缩功能的影响及机制*

余丞浩，王建农，张金艳

（中国中医科学院西苑医院，北京 100091）

双龙方是李连达院士在治疗心血管疾病方面的临床经验方，是根据益气活血化瘀原理，以具有益气功效的人参配伍活血化瘀功效的丹参组方的中药复方制剂，具有益气养血、活血通脉的功效，用于气虚血瘀（本虚标实）之胸痹证，适用于心血管突发性疾病，疗效显著。本研究的前期研究中分别建立了犬[1]、小型猪[2]、大鼠[3]心肌梗死模型，结果表明，双龙方对以上冠状动脉结扎所致心肌梗死模型均有明显治疗作用。进一步观察了双龙方对犬血流动力学的影响，主要有减慢心率，降低心肌耗氧、增加冠状动脉血流量等作用[4]，其作用机制尚不明确。近期的试验结果显示，双龙方可有效防治心肌缺血-再灌注后的无复流现象[5]，并有显著扩张大鼠肠系膜动脉的作用，该作用与抑制电压依赖型钙离子通道功能及5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NA）受体功能有关[6]。但冠状动脉形成起源、生物学特点及药理学特点均不同于其他血管[7-8]，本研究中拟进一步研究其对大鼠离体冠状动脉舒缩功能的影响，进而阐述双龙方对心血管活性作用的机制，为双龙方治疗心血管疾病提供试验依据。现报道如下。

1 材料与方法

1．1 动物、试药与仪器

动物：清洁级，6～7周龄雄性，SD大鼠20只，体质量220～300 g，由北京斯贝福实验动物技术有限公司提供，许可证号为SCXK（京）2016-0002。

试药：氯化钾（KCl，国药集团化学试剂有限公司，批号为20170526）；5-HT（Sigma公司，批号为SLBP9361V）；血栓素A2受体激动剂（U46619，Chem Cruz公司，批号为G2717）；双龙方由人参提取颗粒（2．5 g生药／g）与丹参提取颗粒（10 g生药／g）按人参、丹参生药比例7∶3配制，由中国中医科学院西苑医院提供。药品和试剂均于临用前以0．9%氯化钠溶液配置。

仪器：DMT620型多腔离体微血管金属丝肌动描记仪（ADInstruments Co．，Australia）；精密pH计（Mettler-Toledo Instruments Co．，Shanghai）；连续变倍体视显微镜（Nikon Instruments Co．，Shanghai）。

1．2 方法

离体动脉环制备：颈椎脱臼处死大鼠，分离冠状动脉，放入冷的Krebs液（由氯化钠119 mmol／L，氯化钾4．6 mmol／L，氯化钙1．5 mmol／L，磷酸二氢钠1．2 mmol／L，氯化镁1．2 mmol／L，碳酸氢钠15 mmol／L，葡萄糖5．6 mmol／L[9]组成），显微镜下继续分离冠状动脉，去除周围黏附组织。将处理好的动脉剪为1．5 mm长的圆筒段，即冠状动脉环，4℃保存，备用。

标本挂置及血管活性筛选：显微镜下，以2根25μm的钨丝穿入冠状动脉环内腔，分别以螺丝将2根钨丝的两端固定于肌动描记仪的器官浴槽中。浴槽内盛37℃、pH 7．4的Krebs液，持续通入95%O2和5%CO2的混合气体[10]。调节动脉环基础张力至1．5 mN，平衡1．5 h。

药物浓度设置：将双龙方颗粒用0．9%氯化钠溶液溶解，配置成所需质量浓度。除研究低、中、高质量浓度（相当于每1 L中含8，16，32 g生药）双龙方对血管的直接扩张作用外，根据直接舒张作用研究中的结果，考虑机制研究中需要降低双龙方温育时对血管环平衡后基础张力的影响，以防干扰对机制的研究，故选取效应研究中药物起效浓度的低浓度组，作为该机制研究中的高浓度组。

对大鼠冠状动脉的直接舒张作用：分别用10-5mol／L的5-HT和5×10-7mol／L的U46619收缩血管，张力稳定后，将低、中、高质量浓度（每1 L含8，16，32 g生药，设为Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ组）的双龙方加入器官浴槽，其中空白对照组（Ⅰ组）加等量0．9%氯化钠溶液，考察其对冠状动脉的直接舒张作用。舒张率分别以相对于10-5mol／L 5-HT和5×10-7mol／L U46619预收缩高度的百分比表示。

对电压依赖型钙离子通道功能的影响：检验血管活性良好、张力稳定后，将低、中、高质量浓度（每1 L含2，4，8 g生药，设为B，C，D组）的双龙方加入器官浴槽温育5 min，空白对照组（A组）加等量0．9%氯化钠溶液，各组按累加浓度法加入KCl，记录血管对KCl收缩的量-效曲线，分别计算最大收缩（Emax）及产生最大效应1／2时所需药物的负对数（pEC50）。

表1 不同质量浓度双龙方对预收缩大鼠冠状动脉的舒张作用比较（均数±标准误，n=8）

对受体依赖型钙离子通道功能的影响：检验血管活性良好、张力稳定后，将低、中、高质量浓度（每1 L含2，4，8 g生药，设为B，C，D组）的双龙方加入器官浴槽温育5 min，空白对照组（A组）加等量0．9%氯化钠溶液，各组分别按累加浓度法加入血管收缩性G蛋白偶联受体激动剂（5-HT，U46619），分别计算其Emax及pEC50。

1．3 统计学处理

采用SPSS统计学软件分析。组间数据以均数±标准误表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐性用Student-Newman-Keuls检验；方差不齐用Tamhane′s T2检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 对大鼠冠状动脉的舒张作用

结果见表1和图1。双龙方各组舒张率与Ⅰ组比较，均有显著性差异（P＜0．01）。

图1 双龙方对预收缩大鼠冠状动脉的舒张作用（n=8）

2．2 对电压依赖型钙离子通道功能的影响

结果见表2和图2。与A组比较，D组KCl最大收缩达5-HTEmax显著降低（P＜0．05）；各组间pEC50无显著差异。

表2 不同浓度双龙方对大鼠冠状动脉KCl量-效曲线的影响（均数±标准误，n=8）

图2 双龙方对大鼠冠状动脉KCl量效曲线的影响（n=8）

2．3 对受体依赖型钙离子通道功能的影响

结果见图3和表3、表4。与A组比较，B，C，D组5-HT的Emax均显著降低（P＜0．01），各组间pEC50无显著差异；与A组比较，C组、D组U46619的Emax均显著降低（P＜0．01），各组间pEC50无显著差异。

3 讨论

图3 双龙方对大鼠冠状动脉量效曲线的影响（n=8）

表3 不同质量浓度双龙方对大鼠冠状动脉5-HT量-效曲线的影响（均数±标准误，n=8）

表4 不同质量浓度双龙方对大鼠冠状动脉U46619量-效曲线的影响（均数±标准误，n=8）

通过中国知网、万方数据库，以词频“大鼠”并含“冠状动脉”并含“收缩”或“舒张”为主题词检索1979年至2018年微血管文献，共检索到文献111篇，通过逐一阅读文献摘要排除81篇，保留相关度高的共30篇，其中1991年1篇，1996年1篇，2011年1篇，2013年至2015年12篇，2016年至2018年15篇。可见，随着仪器设备的应用开发与分离技术的提高，大鼠冠状动脉环张力测定试验应用在心血管药物的研究方面正逐渐兴起。

大鼠的微血管尤其是冠状动脉因其壁薄腔小，难以从组织完整分离而不损伤平滑肌，穿金属丝行张力测定时又极易损伤血管内皮，因此分离大鼠冠状动脉行张力测定的操作难度远远大于大鼠的大血管及大型动物（猪、犬、兔等）的微血管。

通过查阅文献[5]和实际操作，整理和总结分离大鼠冠状动脉时，需注意以下几点：避免麻醉药对某些血管平滑肌的功能造成影响，进行血管张力测定试验的大、小鼠应尽量采用颈椎脱臼处死法；应迅速尽可能排空离体心脏里残留淤血，固定在黑色背景衬托的培养皿内，便于血管的观察与分离；尽量降低组织代谢，保持血管良好的活性，血管的分离过程宜在冰浴下进行，同时，整个分离过程宜敏捷而迅速，如单人操作制备4个血管环样本宜控制在40 min以内完成；游离血管时不要钳夹、牵拉血管，以免损伤平滑肌，外周的脂肪组织要尽可能地去除干净；裁取金属丝两端宜使用锐利的器械（如手术剪）剪去，避免金属丝两端曲折变形或有钝芒，进而减少穿越阻力和防止刺伤血管；穿血管的金属丝端应一直保持笔直状态，避免中途折曲而损伤血管内皮，在穿金属丝时手要稳，尽量在血管腔中间一次性穿过，避免钢丝反复摩擦到管壁平滑肌；张力测定全程通以混合气，气流的速度应控制好（以3～5个气泡／秒为宜）；挂置完血管环后，设置好与血管环相匹配的、适宜的标准化初始张力，然后再正式进行试验。由此可知，操作中保持血管平滑肌的完整性与良好活性是血管张力测定试验得以进行的前提。本试验中通过对分离大鼠冠状动脉试验技术的掌握，为本项研究提供了技术保障。

血管收缩功能的主要结构基础是血管平滑肌，血管平滑肌细胞上L型钙离子通道对血管张力的调节起重要作用[11]。根据其调控通道开闭机制的不同，平滑肌细胞膜上的钙离子通道主要可分为电压依赖型和受体依赖型。电压依赖型钙离子通道（VDCC）随着细胞膜去极化而开放，与膜电压变化相关；受体依赖性钙离子通道（RDCC）主要通过平滑肌细胞膜上的G蛋白偶联受体与相应的配体结合后，诱导其开放[6]。平滑肌的收缩调节主要通过电压依赖性钙离子通道的调控[12]。

血栓素A2（TXA2）、5-HT是常见的2种血管舒缩性介质。TXA2主要由血小板中的前列腺素H2在TXA2合酶作用下生成，有促进血小板聚集和收缩血管平滑肌作用，参与多种心血管疾病及肾脏疾病的发生[13]。TXA2收缩血管平滑肌的作用机制为激活环核苷酸门控通道引起细胞内钙增加[14]及激活TXA2受体和磷脂酶C（PLC）[15]。

5-HT又名血清素，为常见的神经递质及血管收缩剂，其受体主要有5-HT1R，5-HTZR，5-HT3R，5-HT4R，5-HT5R，5-HT6R和5-HT7R 7种类型和14种亚型[16-17]。除5-HT3R属配体门控通道外，其余6种均为G蛋白偶联受体。在这些受体中，5-HT2A与5-HT1D受体主要位于血管平滑肌细胞上，当机体内源性释放的5-HT与5-HT2A受体结合后，可促进细胞外钙离子内流，使得血管迅速产生收缩反应。

本研究结果显示，双龙方可浓度依赖性地舒张5-HT和U46619所引起的大鼠冠状动脉收缩，有显著直接扩张冠状动脉血管的作用。双龙方舒张血管的作用机制与抑制电压依赖型钙离子通道开放有关，且能干预5-HT和TXA2所介导的血管收缩效应，推测双龙方舒张大鼠冠状动脉的作用与抑制二者受体有关。

本研究中以大鼠离体微血管组织（冠状动脉）为试验对象，进一步验证了双龙方可改善大鼠的心脏微循环功能。但本研究中所用中药颗粒剂（人参、丹参）由于提取工艺限制，仅涉及多种水溶性成分，不含脂溶性成分，今后可以考虑从配伍组分学的角度，以人参、丹参水溶性和脂溶性成分作相关试验设计及探讨。此外，随着研究微血管技术的提高与相关仪器的开发、改进，今后的研究也可关注脑部微血管疾病，以期能发现新的药理活性作用，从而为拓展中药复方的临床应用范围提供试验依据。

志谢：导师李连达院士生前在双龙方基础试验研究方面，倾注了较多心血，有幸作为他的学生并得到其谆谆教导，不胜感恩！