艾灸对应激性溃疡模型大鼠血清和下丘脑中GAS、SS表达的影响

付晨露 马佳佳 关翰宇 李婧婷 王旒靖 薛 婷 吴颖琦 邵一轩 马惠芳△

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京市顺义区空港医院，北京 101300；3.中国中医科学院广安门医院，北京 100053）

应激性溃疡（SU）是指机体在应激状态下（如训练比赛、长跑等）发生的以炎症糜烂、浅表性溃疡及胃肠道出血为特征的急性胃黏膜病变［1]，是临床上急诊ICU患者常见并发症之一［2]。目前对SU的机制研究尚未完全明了，近年来随着神经胃肠病学研究的不断深入，众多研究表明，消化系统疾病的发生发展与脑肠轴中脑肠肽水平变化密切相关，而胃泌素（GAS）、生长抑素（SS）是与胃肠疾病相关的重要脑肠肽［3-4]。前期实验研究已证明针刺足三里、中脘可通过调控脑肠轴起到治疗SU作用，而关于艾灸足三里、中脘的研究较少，因此本实验以SU模型大鼠为对象，艾灸为干预手段，观察大鼠血清及下丘脑中GAS、SS含量的变化，探讨艾灸对治疗SU的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级7周SD雄性大鼠28只，体质量180～200 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2009-0017。大鼠饲养于北京中医药大学实验动物中心SPF级动物房内，控制环境温度为（22±2）℃，相对湿度 55%～65%，明/暗周期（L/D）为 12 h/12 h，光照时间为 7∶00～19∶00（ZT0-ZT12）。大鼠可自由进食、饮水。实验操作严格参照《关于善待实验动物的指导性意见》［5]，并已通过北京中医药大学动物伦理审查委员会审查。

1.2 试药及仪器

1）试剂：多聚甲醛（鼎国昌盛生物技术有限公司，编号AR-0221）、无水乙醇、二甲苯（北京化工厂）、苏木精染料、伊红染料（东胜泰博科技公司）、GAS酶联免疫检测试剂盒（EIA-2535）、大鼠SS酶联免疫检测试剂盒（ML-ELISA-A10956，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；戊巴比妥钠（Sigma公司生产，货号P3761）、奥美拉唑肠溶胶囊（阿斯利康制药有限公司生产，批号H20030413）。2）仪器：ZK 38型低温离心机（德国Eppendor公司制造）、LEICAEG1150C切片机（德国莱卡制造）；OLYMPUS显微镜（日本奥林巴斯株式会社制造）、OLYMPUS Hyper LCD相机（日本索尼制造）、标准规格酶标仪（Thermo Scientific制造）、自贴式艾炷（高0.8 cm，直径0.7 cm，中研太和有限公司）。

1.3 造模方法

SD大鼠予相同环境饲养。并按随机数字表法将大鼠分为空白组、模型组、艾灸组、药物组，每组各7只。除空白组外，其余3组选用RWIS的改良办法［5]复制SU模型。造模大鼠禁食不禁水36 h后放入自制大鼠固定器（350 mL塑料矿泉水瓶，去瓶盖，剪开距瓶底5 cm处，将大鼠从瓶底剪开处放入，固定瓶底），将瓶身直立浸入温度约 （20±1）℃的水中，浸泡3 h后取出，造模成功。造模后第3天，除空白组外其余各组重复上述造模过程再行治疗。

1.4 干预方法

穴位定位参照《实验针灸学》［6]，其中足三里位于膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm，双侧选穴；中脘位于脐上约20 mm。参考相关文献［7-8]，将艾灸组大鼠仰卧位束缚于鼠板上，用自贴式小艾炷灸双侧足三里穴及中脘穴，观察大鼠肢体反应，以其安静耐受为度，每穴连续灸3壮。空白组及模型组大鼠每日用同样的方法进行束缚固定，但不进行艾灸治疗。药物组大鼠每日予奥美拉唑溶液2 mL灌胃 （用蒸馏水溶解奥美拉唑肠溶胶囊粉末，质量浓度为0.02 mg/mL），所有组皆在造模后第1天开始治疗，连续5 d。

1.5 标本采集与检测

实验结束后，将大鼠用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉，快速取血、取胃、取脑。

1.5.1 胃黏膜损伤指数测定 取血后结扎大鼠贲门和幽门，向胃内注入10%多聚甲醛固定液10 mL，将全胃取下，置于固定液中10 min后取出，沿胃大弯剪开，用0.9%氯化钠注射液冲去胃内容物，铺于平板上，充分暴露溃疡，按Guth［9]标准记录即按照黏膜病变长度计算：斑点糜烂为1分；糜烂＜1 mm为2分；1～2 mm为3分；2～3 mm为4分；＞3 mm为5分；宽度＞2 mm时分值×2，最后将所得分相加即为溃疡指数（UI）。

1.5.2 HE染色观察胃组织形态学 取含溃疡灶的胃组织，约5 mm×5 mm大小，放于10%多聚甲醛液中进行固定，石蜡包埋，切片厚约5 μm，隔1张取1张，每个标本取4张，随后进行HE染色，切片经二甲苯脱蜡后，酒精下行入水，用流水冲洗3 min后用苏木素复染10 min，再用流水冲洗15 min，随后用盐酸酒精分色30 s，然后流水蓄化15 min，再用伊红溶液复染10 min，最后酒精上行脱水，二甲苯透明30 min，封片结束。光学显微镜下观察。

1.5.3 血清GAS、SS的含量检测 以腹腔主动脉采血5 mL，分离血清，保存于-80℃冰箱备测，按照酶联免疫试剂盒说明书进行，测定各孔的吸光度值，计算出样品浓度。

1.5.4 下丘脑GAS、SS含量检测 大鼠断头后迅速在冰上取脑，剥离出下丘脑，称质量，匀浆，匀浆后放入离心机中，4℃，3 000 r/min，15 min。取上清，放入-80 ℃冰箱中待测，按照酶联免疫试剂盒说明书进行，测定各孔的吸光度值，计算出样品浓度。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠胃黏膜损伤指数UI比较

见表1。与空白组相比，其余3组大鼠的胃黏膜损伤指数明显升高（P＜0.01）。与模型组相比，艾灸组和药物组大鼠的胃黏膜损伤指数显著降低 （P＜0.05或P＜0.01）。与药物组相比，艾灸组大鼠的胃黏膜损伤指数一定程度降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠胃黏膜损伤指数UI比较（分，±s）

表1 各组大鼠胃黏膜损伤指数UI比较（分，±s）

与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同

组 别 n UI空白组 7模型组 7艾灸组 7 0±0 50.86±17.88*20.43±8.77*△△药物组 733.00±8.81*△

2.2 各组大鼠胃黏膜形态学的光镜下观察结果

见图1。空白组大鼠胃黏膜上皮完整，结构清楚，黏膜腺体整齐排列，未见红细胞渗出。模型组大鼠黏膜上皮缺损，腺体紊乱或被破坏，黏膜充血，可见大量红细胞渗出，胃黏膜细胞肿胀。艾灸组大部分胃黏膜结构较为正常，上皮较完整，红细胞渗出较少，偶见少量细胞坏死。药物组胃黏膜结构基本完整，细胞轻度水肿，红细胞渗出较少。

图1 各组大鼠胃黏膜组织（HE染色，200倍）

2.3 各组大鼠血清和下丘脑中GAS含量比较

见表2。与空白组相比，模型组的大鼠血清和下丘脑中GAS含量均升高（P＜0.01）。与模型组相比，艾灸组和药物组大鼠的血清和下丘脑中GAS含量均降低（P＜0.01）。与药物组相比，艾灸组大鼠的血清和下丘脑中GAS含量略降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠血清和下丘脑中GAS含量比较（ng/L，±s）

表2 各组大鼠血清和下丘脑中GAS含量比较（ng/L，±s）

组 别 n 血清GAS 下丘脑GAS空白组 7 36.39±1.95 55.02±8.52模型组 7 47.22±3.05* 66.28±3.97*艾灸组 7 29.65±2.55△△ 48.16±3.67△△药物组 7 30.88±2.17△△ 48.79±5.35△△

2.4 各组大鼠血清和下丘脑中SS含量比较

见表3。与空白组相比，模型组大鼠的血清和下丘脑中SS含量均降低（P＜0.05）。与模型组相比，艾灸组及药物组大鼠的血清和下丘脑中SS的含量均明显升高（P＜0.01）。与药物组相比，艾灸组大鼠的血清和下丘脑中SS含量无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠血清和下丘脑中SS含量比较（ng/L，±s）

表3 各组大鼠血清和下丘脑中SS含量比较（ng/L，±s）

组 别 n 血清SS 下丘脑SS空白组 7 64.20±4.24 101.17±6.44模型组 7 51.72±6.62* 88.70±10.73*艾灸组 7 78.35±8.79△△ 124.07±10.89△药物组 7 81.70±15.77△△ 119.73±6.47△△

3 讨 论

灸法作为中医三大疗法之一，具有激发人体正气，预防疾病，强壮补虚的功效。《扁鹊心书》说“人于无病之时，常灸关元、气海、命关（食窦穴）、中脘……虽未得长生，亦可保百余年寿矣”。现代研究也表明［10]，艾灸具有镇痛、改善血循环、调节免疫防御功能、调节代谢紊乱和脏腑功能作用。中医认为本病归属于胃脘痛、嘈杂、痞证等范畴，治疗应和胃止痛。“足三里”为足阳明胃经合穴，又为胃之下合穴，“合治内府”。“中脘”为胃之募穴，合募相配，共奏升清降浊，健脾和胃，行气止痛之功，研究表明［11]艾灸足三里、中脘可促进大鼠胃黏膜损伤的修复，起到保护胃黏膜作用。本实验研究结果显示艾灸组及药物组大鼠胃黏膜UI均降低，说明艾灸足三里、中脘可起到与口服奥美拉唑肠溶片相同的疗效，能够尽快修复胃黏膜损伤，且光镜结果亦显示艾灸组及药物组胃黏膜上皮细胞排列较为整齐，红细胞浸润程度降低，说明艾灸足三里及口服奥美拉挫肠溶片具有良好的修复效果，与之前研究结果一致。

研究表明［12]SU的发生与胃酸分泌增加、胃肠道黏膜屏障保护功能减低及神经内分泌功能失调相关。脑肠轴是将认知和情感中枢与神经内分泌、肠神经系统和免疫系统相联系的双向交通通路，是能在不同层次将胃肠道与中枢神经系统联系起来的神经-内分泌网络，机体通过神经-内分泌网络对胃肠功能进行的双向调节称之为脑肠互动［13]，脑肠肽在脑肠轴各个环节中起着重要的调控作用，而分布于中枢神经系统和胃肠道中的脑肠肽，调控着胃肠运动、感觉、分泌、吸收等复杂功能，若机体长期处于应激状态，会导致神经内分泌免疫失调，表现为脑肠互动、脑肠肽分泌异常［14]。本实验选GAS、SS为参考指标，其中GAS是最强的促胃酸分泌激素［15]，主要由胃窦及十二指肠黏膜的G细胞分泌的一种多肽类激素，主要作用是促进胃酸、胃蛋白酶分泌，促进胃肠道黏膜生长，若胃泌素水平过高，使胃酸过度分泌，可破坏胃黏膜保护屏障，引发溃疡或减慢溃疡的愈合速度［16]。 赵辉［17]研究发现脑外伤并发应激性溃疡患者血清GAS水平升高，予抗溃疡治疗后，GAS水平显著降低；SS主要分布于肠神经系统、胃体和胃黏膜内的D细胞中，对胃肠道有广泛抑制作用。在胃中，SS可以通过G蛋白介导直接作用于制酸的壁细胞从而减少胃酸分泌，也可通过抑制5-HT、胃饥饿素、组胺水平从而间接减少胃酸［18]，促进黏膜修复。王美林［19]研究表明，抗溃疡治疗后，SS 水平升高，GAS 水平降低，两者数值的平衡在促进溃疡修复中发挥重要作用，由此可见GAS和SS可通过相互作用调节胃酸分泌。本实验研究结果显示束缚-浸水法造模后，大鼠血清及下丘脑中的GAS水平明显升高、SS水平显著降低，提示脑肠肽水平、脑肠互动出现异常，经艾灸及奥美拉唑肠溶片治疗后GAS水平明显降低，SS水平显著升高，提示艾灸“足三里”及“中脘”或服用奥美拉唑肠溶片可以调节脑肠肽水平，使脑肠互动恢复正常。

综上所述，本实验从观察胃黏膜损伤指数UI，HE染色红细胞渗出程度及血清与下丘脑中胃泌素和生长抑素水平的变化，证实了艾灸足三里、中脘穴可对应激性溃疡大鼠起到良好的治疗效果，其机制可能是通过调节脑肠肽水平的动态平衡，调控脑肠轴，从而使胃肠运动恢复正常，胃黏膜损伤得以恢复。