丹红注射液对缺血性中风大鼠舌象的干预研究*

林筱洁 万浩宇 李志威 周惠芬 虞 立 杨端昕 杨洁红 万海同△

（1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学第一临床医学院，浙江 杭州310006）

缺血性中风又称脑梗死，是中老年人群常见的急症，且近年有发病年龄年轻化的趋势，我国大概有10%～15%患者是45岁之前发病的［1]。因此缺血性中风的早期防治是一个重要的研究方向。缺血性中风的常见中医证型为风痰瘀阻证、痰热腑实证、气虚血瘀证等，血瘀既作为缺血性中风的病理产物又作为致病因素，贯穿整个疾病过程［2]。“瘀生五邪”加剧脑缺血损伤［3]。 梗死证属“血瘀证”者可占 40%［4]。 因此活血化瘀药广泛应用于缺血性中风的治疗。丹红注射液就是临床广泛使用的活血化瘀药之一。我们在前期研究发现丹红注射液能有效治疗缺血性中风大鼠［5-6]，PET检查显示缺血灶减小，能抗氧化、抗血栓、抗凋亡、促进神经元成熟，保护神经胶质细胞。因此研究丹红注射液对缺血性中风血瘀证的影响具有临床参考价值。舌象临床表征一直是临床诊断的重要依据，舌质紫暗、少腹部抵抗压痛、脉涩等对血瘀证诊断的贡献最大［7]。2011年修订的血瘀证中西医结合十二条诊断标准［8]及2016年修订的实用血瘀证诊断标准［9]都可说明舌质紫暗、舌下静脉曲张、瘀血等舌象在血瘀证诊断中具有重要作用。临床研究还发现舌象的改变与脑梗死患者血液中的纤维蛋白原水平和中性粒细胞计数有关，与急性脑梗死患者的神经功能缺损程度有关，还与患者的脑梗死部位有关［10-12]。观察丹红注射液对血瘀证相关舌象的改善作用具有重要研究价值和实际临床意义。本研究参照文献［13-16]对缺血性中风大鼠血瘀证相关舌象进行分析，并研究其与脑梗死的相关性，同时观察丹红注射液治疗后舌象的变化，证实丹红注射液可以有效干预缺血性中风大鼠血瘀证相关舌象并促进神经功能恢复，为其临床疗效提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠，鼠龄2～3个月，体质量为270～280 g，共40只。购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，动物饲养于浙江中医药大学动物实验中心层流屏障内，许可证号SCXK（沪）2013-0016。

1.2 药物与仪器 1）药物：丹红注射液（山东丹红制药有限公司提供，国药准字Z20026866，批号2018011035；玻璃安瓿每支装10 mL，含丹参、红花提取物）。丁苯酞注射液（石药集团恩必普药业有限公司生产，国药准字H20100041，批号 20170808，100 mL∶25 mg）。 特耐（注射用帕瑞昔布钠针，辉瑞制药有限公司生产，国药准字J20080045，批号 T13127）。 2）仪器：佳能 IXUS1100HS型数码照相机（1 210万像素，佳能株式会社生产）；标准色卡（美国爱色丽公司生产）。栓线（2636-A4，线身直径0.26 mm，北京西浓科技有限公司生产）；恒温毯（型号TT160X80-1，张家港市科兴碳纤维制品有限公司生产）。

1.3 分组与造模 SD大鼠随机分为假手术组、模型组、丹红注射液组和丁苯酞组，每组5只。参考Longa等［17]报道的改良线栓法及文献［18]，简要方法如下。随机选取雄性SD大鼠，术前12 h禁食，但不禁水，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，肌肉注射特耐1.4 mg/kg止痛。经右侧颈总动脉、颈内动脉将线栓入颅，并顺其推进18～22 mm（自颈总动脉分叉处计算），稍遇阻力时即可停止前进，可造成大脑中动脉（MCA）血流的阻断。缺血1 h后缓慢拔出线栓进行再灌注。另设假手术组，结扎右侧颈总动脉近端及远端，不插入线栓。大鼠手术中注意保温，均放置于恒温毯上，直至术后清醒。

1.4 给药方法 给药剂量按大鼠与人体表面积等效剂量折算，丁苯酞注射液组按照成人用量［50 mg/60（kg·d），静脉滴注，每日2次，每次25 mg]的6.25倍，计算大鼠用量为0.52 mg/100（g·d）。丹红注射液组按照成人用量［40 mL/60 （kg·d）]的 6.25 倍，计算大鼠用量为0.42 mL/100（g·d）。分别于手术前0.5 h和再灌注即刻、再灌注后3、6、18 h尾静脉注射相应药物各1次。假手术组和模型组大鼠则在同样时间点注射无菌0.9%氯化钠注射液 0.42 mL/100 （g·d）。

1.5 大鼠神经行为学评分［17]在大鼠清醒后于再灌注23 h（术后24 h）观察神经缺损程度，由3人判断、按4分制进行行为学计分。0分：无障碍；1分：不能完全伸左侧前肢；2分：向左侧转圈；3分：向左侧倾倒；4分：意识不清，无自主活动。

1.6 大鼠舌象图像采集和分析 拍摄部位：舌腹面、舌背面。大鼠处于深麻醉状态下取仰卧位，用镊子轻轻夹住大鼠舌尖从左轻轻拉出，直至露出舌根部，使整个舌体与大鼠躯干呈直线或有小于15°的夹角。于术后24 h约下午4∶00在同一室内同一日光灯下观察大鼠舌象，用数码相机并配合标准色卡拍照。应用Photoshop 5.0软件根据标准色卡对所有照片进行校正，然后分析计算舌色的校正红色值（R）、校正绿色值（G）、校正蓝色值（B）。校正R值＝（标准色卡标准R值-标准色卡标准黑色值）×（舌象R值-标准色卡实际黑色值）/（标准色卡实际R值-标准色卡实际黑色值）。校正G值＝（标准色卡标准G值-标准色卡标准黑色值）×（舌象G值-标准色卡实际黑色值）/（标准色卡实际G值-标准色卡实际黑色值）。校正B值＝（标准色卡标准B值-标准色卡标准黑色值）×（舌象B值-标准色卡实际黑色值）/（标准色卡实际B值-标准色卡实际黑色值）。舌背面舌下脉络显色长短分级计分标准［16]如下：舌下脉络色泽红润，显色约1/3舌体长计0分；舌下脉络色泽紫暗，显色大于1/3小于1/2舌体长计1分；舌下脉络色泽紫暗，显色约1/2舌体长计2分；舌下脉络色泽紫黑，血管明显增粗，显色约2/3舌体长计3分。

1.7 脑梗死体积测算 术后24 h，观察舌象、神经行为学评分结束后，大鼠断头取脑，-20℃冰箱冷冻10～15 min，作均匀冠状切片 6片（厚约 2 mm），用 2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）37 ℃染色 13 min。 未缺血脑组织颜色为玫瑰红色，缺血区变白色。数码相机拍照，输入电脑，用Image J图像分析软件计算脑片的梗死面积。分析计算每一脑片正常侧及缺血侧脑半球TTC 染红（未缺血区）的面积，参照文献的方法［19]，将两者相减得到校正后的缺血面积，以消除脑水肿对梗死体积的影响。然后将每一脑片的缺血面积乘以脑片厚度，再将各脑片数值相加，得到全脑梗死体积的近似值，最后除以正常侧脑半球体积，得到梗死体积百分比。梗死体积百分数计算公式为（左侧未梗面积之和-右侧未梗面积之和）/左侧未梗面积之和×100%

1.8 统计学处理 所得数据经正态分布及方差齐性检验后进行方差分析，统计分析工具为SPSS 17.0软件包，计量资料以 （±s）表示。相关性分析也采用SPSS17.0软件包进行pearson相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 缺血性中风模型大鼠舌色变化与梗死灶体积的相关性 见图1～图3。采用SPSS软件分别分析缺血性中风模型大鼠舌色与TTC染色梗死灶大小的相关性，缺血性中风模型大鼠舌色的校正R值、校正G值、校正B值与TTC染色脑梗死体积均密切相关，且差异有统计学意义（分别为P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。 缺血性中风大鼠舌下脉络与TTC染色脑梗死体积的相关性分析差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 缺血性中风大鼠舌色的校正R值与TTC染色脑梗死体积的相关性

图2 缺血性中风大鼠舌色的校正G值与TTC染色脑梗死体积的相关性

图3 缺血性中风大鼠舌色的校正B值与TTC染色脑梗死体积的相关性

2.2 各组大鼠腹面舌色的变化 见图4。假手术组大鼠舌色淡红，缺血性中风模型组大鼠舌色偏暗，丁苯酞注射液组大鼠舌色改善明显，丹红注射液组大鼠的舌色也明显得到改善。

图4 各组大鼠腹面舌色的变化

2.3 各组大鼠舌色校正R、G、B值的比较 见表1。舌色分析结果显示，缺血性中风大鼠模型组舌色的校正红色值（R值）、校正绿色值（G值）、校正蓝色值（B值）均显著低于假手术组大鼠（均P＜0.01）。丁苯酞组大鼠舌色校正R、G、B值显著高于模型组（分别为P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05）。 丹红注射液组大鼠舌色校正 R、G、B值显著高于模型组，趋向正常水平（分别为P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05）。丹红注射液组与丁苯酞组大鼠的舌色校正R、G、B值差异无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 各组大鼠舌色的校正R、G、B值比较（±s）

表1 各组大鼠舌色的校正R、G、B值比较（±s）

与缺血性中风模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较，△△P＜0.01。 下同

组 别 n 校正B值校正R值 校正G值假手术组 5 145.9±13.6缺血性中风模型组 5 97.1±1.8△△丹红注射液组 5 132.6±14.0*201.8±12.0 114.9±11.2 159.5±10.2△△ 82.4±10.9△△188.3±11.0** 104.6±17.5*丁苯酞注射液组 5 119.8±8.0*181.7±10.0** 99.8±7.1*

2.4 各组大鼠背面舌象的变化 见图5，表2。假手术组大鼠舌下脉络色泽红润，显色小于1/3舌体长。模型组大鼠舌下脉络色泽紫暗，有的血管明显增粗，显色大于1/3舌体长，最长约2/3舌体长。丁苯酞注射液组大鼠舌下脉络色泽较模型组明显改善，显色长度缩短，差异有统计学意义（P＜0.01），趋向假手术组。丹红注射液组大鼠舌下脉络色泽较模型组改善，显色长度缩短，有统计学差异（P＜0.01），也趋向假手术组。丹红注射液组与丁苯酞注射液组大鼠的舌下脉络评分无明显差异（P＞0.05）。

图5 缺血性中风大鼠背面舌象图

表2 各组大鼠舌下脉络评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠舌下脉络评分比较（分，±s）

组 别 n 舌下脉络评分假手术组 5缺血性中风模型组 5丹红注射液组 5 0 2.40±0.55 1.20±0.45**丁苯酞注射液组 50.80±0.45**

2.5 缺血性中风大鼠神经行为学评分比较 见表3。与缺血性中风模型组大鼠比较，丁苯酞注射液组大鼠的神经行为学评分明显下降（P＜0.05）。丹红注射液组大鼠的神经行为学评分也明显下降（P＜0.05）。丹红注射液组与丁苯酞注射液组大鼠的神经行为学评分无明显差异（P＞0.05）。

表3 各组大鼠神经行为学评分比较（分，±s）

表3 各组大鼠神经行为学评分比较（分，±s）

组 别 n 神经行为学评分假手术组 5缺血性中风模型组 5丹红注射液组 5 0 2.20±0.45 1.40±0.55*丁苯酞注射液组 51.20±0.45*

2.6 各组大鼠脑梗死体积比较 见表4。假手术组大鼠的大脑TTC染色无梗死灶，缺血性中风模型组大鼠大脑TTC染色可见明显梗死灶，丁苯酞组大鼠的脑梗死得到明显改善，梗死灶明显缩小（P＜0.01）。丹红注射液组大鼠的脑梗死得到明显改善，梗死灶缩小（P＜0.01）。丹红注射液组与丁苯酞组大鼠的脑梗死体积差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组大鼠脑梗死体积比较（%，±s）

表4 各组大鼠脑梗死体积比较（%，±s）

组 别 n 脑梗死体积假手术组 5缺血性中风模型组 5丹红注射液组 5 0 43.54±1.89 13.60±0.41**丁苯酞注射液组 58.15±0.18**

3 讨 论

缺血性中风作为一种中老年人常见的急症，具有高致残率、高死亡率、高复发率和高花费率，联合中医中药常能获得更好的疗效并降低治疗费用。血瘀证是缺血性中风的主要证型。舌象作为临床表征是血瘀证的重要依据。舌色的红色值（R值）、绿色值（G值）、蓝色值（B值）越大，则越接近于其代表的颜色。缺血性中风大鼠舌色接近紫暗，校正R值、G值、B值均显著低于假手术组大鼠（均P＜0.01）。我们观察了缺血性中风模型大鼠舌色校正R、G、B值与脑梗死体积的关系，结果显示均密切相关。证实了缺血性中风模型大鼠血瘀证相关舌象具有实际应用价值，适合用来观察丹红注射液对其血瘀证相关舌象的干预研究。也为其他活血化瘀药的疗效观察提供模型和方法。本文证实了丹红注射液对缺血性中风大鼠血瘀证相关舌象具有明显的改善作用，且舌象与脑梗死体积均密切相关，这也为临证辨证施治提供了科学依据。

目前有关大鼠舌象的研究，宏观和微观观察方面均取得了一定的进展，利用了计算机软件等辅助手段，在技术层面观察方式已经比较完善。特别是应用数码相机拍摄大鼠舌象后，通过Image-proplus医学图像分析系统软件分析大鼠舌色，可以更客观地观察舌色的改变。但是病理状态舌象仅通过经验判断，缺乏统一的标准［19]。为了客观、定量地评价缺血性中风模型大鼠的舌象变化，我们在舌象采集过程中也注意在当日同一时间点、同一地点、同一日光灯下进行拍摄，以避免光线不同的影响。在采集过程中，我们应用了标准色卡，在一定程度上排除了拍摄角度、距离对舌象的影响［20]。我们还采用了舌色校正公式进行计算以获得校正R值、校正G值和校正B值，且验证了其与脑梗死体积均相关，因此我们的舌象采集和分析方法是比较客观和可靠的。本文为中医证候动物模型评价提供了依据，为中医望诊内容的血瘀舌象的客观化、定量化提供了一种较为可靠的方法。

本文采用的是改良Longa法制备的缺血性中风大鼠模型，通过线栓法入颅导致大脑中动脉（MCA）血流的阻断，造成了确定可控的缺血性脑梗死灶，能很好地模仿缺血性中风患者的病理状态，适合观察药物的作用及其机制。我们在前期的实验和PET检查均发现丹红注射液能有效治疗缺血性中风大鼠［5-6]，ELISA结果显示丹红注射液能提高6-keto-PGF1α水平、SOD活性、血浆t-PA水平，同时降低MDA和PAI活性，降低TNF-α和IL-1β表达，免疫组化结果显示丹红注射液能促进Bcl-2表达，降低Bax表达，促进神经元成熟，NeuN表达增加，促进神经胶质细胞表达GFAP，促进vWF表达，降低GLUT1表达。

在此基础上，本文观察到与缺血性中风模型组大鼠比较，丹红注射液组大鼠舌色校正R、校正G、校正B值显著高于模型组，说明丹红注射液可以显著改善大鼠舌色，使其更接近于假手术大鼠。丹红注射液组舌背面舌下脉络色泽较模型组改善，显色长度缩短。这些从舌象的角度说明了丹红注射液具有活血化瘀的作用。丹红注射液组神经行为学评分也明显下降，脑梗死灶缩小（P＜0.05或P＜0.01）。丹红注射液组与阳性对照丁苯酞注射液组的各指标比较无统计学差异（均P＞0.05），这说明DHI与丁苯酞注射液的疗效相当。至于缺血性中风大鼠舌下脉络与TTC染色梗死体积的相关性分析无显著性差异（P＝0.051）。这可能与舌下脉络评分较为主观，且动物数较少有关。我们将进一步扩大动物数，再选择更为客观的舌部组织的分子学指标，深入研究丹红注射液对缺血性中风大鼠血瘀相关舌象的改善作用。