基于JAK2/STAT3信号通路探讨姜黄素改善脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的作用研究*

石青青 苏湘川 杨小平 刘丙进

（1.浙江省台州市立医院，浙江 台州 318000；2.台州职业技术学院，浙江 台州 318000）

急性肺损伤是以肺泡-毛细血管通透性增加为特 征的一种呼吸道感染类疾病，可急性加重转变为急性呼吸窘迫综合征，急性肺损伤预后差，其病死率可达到40%［1]。在急性肺损伤疾病发展过程中，各种炎症介质，包括肿瘤坏死因子 α（TNF-α）和白介素-8（IL-8），引起级联反应导致中性粒细胞在肺部积聚［2-3]。因此，抑制炎症介质的分泌可以改善急性肺损伤的病理进程。目前，临床上对急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的治疗还以对症支持治疗为主，尚缺乏有效的治疗手段和特效药。姜黄素是姜黄的活性成分，从姜黄根茎中分离得到，具有广泛的抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤等多种药理作用［4]。姜黄素在重症急性胰腺炎大鼠模型中具有治疗作用，同时在顺铂诱导的小鼠肾毒性中抑制了肾炎，提示姜黄素具有抗炎的作用［5-6]。Janus激酶2-信号转导转录激活因子3（JAK2/STAT3）信号通路在细胞因子刺激下被激活，并将生物信号传递给靶细胞，参与细胞增殖、炎症和纤维化的基因的调控［7]。研究显示，JAK2/STAT3信号通路参与了胰腺炎的病理变化过程，但姜黄素改善急性肺损伤的作用是否通过JAK2/STAT3信号通路的调控尚不清楚［8]。因此，本研究小鼠腹腔注射脂多糖建立急性肺损伤模型，探讨姜黄素通过JAK2/STAT3信号通路对急性肺损伤的改善作用，为急性肺损伤的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取雄性6～9周龄昆明种小鼠30只，体质量 18～24 g，动物饲养在温度 22～24℃、相对湿度为40%～70%、噪音≤50 dB的环境中自由进食和饮水，控制饲养环境昼夜循环（12 h/12 h），动物相关处置均符合 《中华人民共和国实验动物管理条例》［9]要求，适应性喂养1周后进行实验。

1.2 试药与仪器 1）试药：姜黄素和脂多糖（Sigma公司，美国）；昆明种小鼠（河北医科大学实验动物中心提供，中国）；戊巴比妥钠（上海上药新亚药业有限公司，中国）；BCA蛋白测定试剂盒和Western blotting试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，中国）；TNF-α和IL-8 ELISA试剂盒 （上海酶联生物科技有限公司，中国）；蛋白抽提试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，中国）；鼠抗 JAK2、p-JAK2、STAT3 和 p-STAT3 单克隆抗体（Santa Cruz公司，美国）；辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗鼠IgG二抗和鼠抗GADPH单克隆抗体（武汉艾美捷科技有限公司，中国）；聚偏乙烯二氟膜（PVDF 膜）（Millipore公司，美国）；ECL 化学发光液（北京索莱宝科技有限公司，中国）；HBS-1096B酶标仪（南京德铁实验设备有限公司，中国）；HE染色试剂盒（中国国药集团，中国）。2）仪器：组织脱水机、包埋机、全自动轮转切片机等病理配套设备（Leica公司，德国）；凝胶成像仪（UVP公司，美国）；BIO-RAD垂直电泳仪（BIO-RAD公司，美国）；台式冷冻离心机Sorvall STR ATOS（Heraeus 公司，德国）；光学显微镜（Nikon公司，日本）。

1.3 分组及给药 对小鼠进行编号，分配选取的随机数字，用随机数字法将小鼠均分为3组，每组10只：对照组、模型组和姜黄素干预组。姜黄素溶液用生理盐水配制成100 mg/mL的储备液备用，姜黄素干预组连续灌胃给予姜黄素（100 mg/kg），对照组和模型组给予等量（2 mL）的生理盐水，7 d，每日 1 次。

1.4 模型制备 末次给药1 h后模型组和姜黄素腹腔注射给予脂多糖（10 mg/kg），对照组给予腹腔注射等量（0.2 mL）生理盐水，6 h后麻醉处死大鼠进行相关检测。

1.5 标本采集及检测 1）大鼠肺组织切片观察：每组取5只小鼠右肺上叶用10%甲醛固定，经脱水、包埋、将蜡块切成3 μm厚切片、摊片、烤片后进行苏木精-伊红（HE）染色，最后用中性树脂封片。用光学显微镜观察肺组织学变化。2）肺湿重/干重（W/D）比：每组用5只小鼠分离左侧左肺上叶，用滤纸吸弃肺组织表面水分，称湿重（W），用恒温干烤箱于110℃烘烤24 h，称取余重即为干重（D）。计算肺组织W/D＝W（mg）/D（mg）。3）支气管肺泡灌洗及蛋白、TNF-α和 IL-8含量的测定：每组用5只小鼠结扎右侧主支气管近端和气管远端，在气管结扎下端用0.3 mL预冷生理盐水进行左肺灌洗，重复3次，回收支气管肺泡灌洗液，离心取上清，根据BCA蛋白测定试剂盒说明书检测支气管肺泡灌洗液中蛋白含量的测定；用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8，按照ELISA试剂盒说明书进行TNF-α和IL-8的测定。4）Western Blotting法检测JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平：每组取5只小鼠右肺中叶，用研钵进行研碎，根据肺组织质量加入相应量蛋白抽提试剂，裂解2 h，离心取上清，进行蛋白定量；调整蛋白浓度，用SDS－PAGE）凝胶进行电泳，每孔上样量20 μg，然后将蛋白转膜到PVDF膜上，加入封闭液封闭1 h，孵育一抗［JAK2（1∶1 000）、p-JAK2 （1∶500）、STAT3 （1∶500）、p-STAT3（1∶500）、GADPH（1∶4 000）]，4 ℃孵育过夜，孵育二抗［山羊抗鼠（1∶5 000）]，用 ECL 显色液显色后进行曝光显影，采集图像，对免疫印迹条带灰度值并进行分析。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。实验结果以（±s）表示，用单因素方差分析进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠小鼠肺组织病理变化 见图1。对照组小鼠肺组织切片未见明显异常，肺泡结构完整，肺泡腔清晰未见水肿液，肺泡毛细血管无充血。模型组小鼠肺组织切片见肺泡壁部分增厚，细支气管腔内有大量脱落炎细胞及渗出物，泡壁毛细血管充血严重。姜黄素干预组小鼠肺组织肺泡壁部分增厚，肺泡内炎症细胞渗出及毛细血管出血较模型组轻。

2.2 各组小鼠肺组织W/D和支气管肺泡灌洗液中蛋白含量的比较 见表1。与对照组比较，模型组肺组织W/D和支气管肺泡灌洗液中蛋白含量增加，给予姜黄素干预后，肺组织W/D和支气管肺泡灌洗液中蛋白含量降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 各组小鼠肺组织病理变化（HE染色，200倍）

2.3 各组小鼠支气管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8水平的比较 见表2。与对照组比较，模型组支气管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8含量增加，给予姜黄素干预后，支气管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8含量降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组小鼠肺组织W/D和支气管肺泡灌洗液中蛋白含量的比较（±s）

表1 各组小鼠肺组织W/D和支气管肺泡灌洗液中蛋白含量的比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。 下同

组 别 n W/D 蛋白含量（mg/mL）对照组 5 2.35±0.08 107.03±11.89模型组 5 5.85±0.22* 359.68±24.08*姜黄素干预组 5 3.71±0.18*△ 155.64±18.43*△

2.4 各组小鼠肺组织中 JAK2、p-JAK2、STAT3和 p-STAT3蛋白表达的比较 见表3和图2。与对照组比较，模型组和姜黄素干预组小鼠肺组织中JAK2和STAT3蛋白表达变化不显著，差异无统计学意义（P＞0.05），模型组小鼠肺组织中p-JAK2和p-STAT3蛋白表达增加，给予姜黄素干预后，小鼠肺组织中p-JAK2和p-STAT3蛋白表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组小鼠支气管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8水平的比较（ng/L，±s）

表2 各组小鼠支气管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8水平的比较（ng/L，±s）

组 别 n TNF-α IL-8对照组 5 0.27±0.03 0.06±0.01模型组 5 1.57±0.10* 0.24±0.05*姜黄素干预组 5 0.54±0.08*△ 0.17±0.01*△

表3 各组小鼠肺组织中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表达的比较（±s）

表3 各组小鼠肺组织中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表达的比较（±s）

组 别 n JAK2 p-JAK2 STAT3 p-STAT3对照组 5模型组 5 0.85±0.15 0.21±0.02 0.70±0.06 0.12±0.01 0.81±0.08 0.54±0.06* 0.64±0.08 0.76±0.09*姜黄素干预组 50.88±0.14 0.41±0.04*△ 0.72±0.03 0.29±0.05*△

3 讨 论

图2 各组小鼠肺组织中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表达的条带

脂多糖是内毒素的主要成分，是革兰阴性菌外膜的主要组成部分，具有一定的炎症活性，被认为是诱导急性肺损伤发生的重要因素［10]。W/D和支气管肺泡灌洗液中蛋白含量是血管内皮通透性障碍所致肺水肿的指标，用于评估实验性肺损伤［11]。在本研究中，模型组小鼠这两个参数均较对照组有所增加，且病理结果显示出现广泛的组织学肺损伤，证明脂多糖诱导了急性肺损伤。姜黄素是从姜黄根中提取的多酚，已被证明可以减少炎症反应，在再灌注引起的心肌缺血中起到显著的心脏保护作用［12]。在本研究中，姜黄素预处理显著降低了脂多糖诱导W/D和支气管肺泡灌洗液中蛋白含量，而且减轻肺组织学改变。这些结果提示姜黄素对内毒素诱导的急性肺损伤具有明显的保护作用。

目前，急性肺损伤的发病机制尚不清楚。一般认为，细胞因子和炎症介质的过量释放在急性肺损伤中起关键作用［13]。炎症介质TNF-α和IL-6等影响感染性疾病的结果，特别是引发全身炎症反应，使相关疾病的死亡率增加［14]。在急性胰腺炎的研究中发现，血清中TNF-α和IL-6水平显著增高，在给予姜黄素治疗后，TNF-α和IL-6水平降低，本研究结果与之相一致，提示姜黄素可通过抑制炎性细胞因子减轻急性肺损伤［15]。

JAK2/STAT3信号通路是细胞因子和生长激素受体信号通路必不可少的通络。越来越多的证据表明，JAK2/STAT3信号通路参与炎症性疾病［16]。值得注意的是，细胞因子信号抑制因子3（SOCS3）通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活，参与了IL家族细胞因子对JAK2/STAT3信号通路的调控［17]。中性粒细胞和巨噬细胞中脂多糖可激活SOCS3，SOCS3在肺部的功能以前已经被研究过，SOCS蛋白在多个刺激下被激活，并抑制JAK2/STAT3信号通路［18]。在高糖处理的A549肺上皮细胞，SOCS3被激活，抑制JAK2/STAT3信号通路的磷酸化，表明SOCS3是JAK2/STAT3信号通路的负调控因子，参与了炎症反应，在炎症因子与JAK2/STAT3信号通路中起了桥梁作用［19]，激活JAK2/STAT3信号通路诱发IL-8在肺泡细胞过表达。值得注意的是，研究表明姜黄素作为JAK2/STAT3通路的抑制剂，在一些实验模型和人类疾病中发挥了显著的作用［20]。本研究发现，在小鼠急性肺损伤模型中，JAK2和STAT3的磷酸化明显增加，而姜黄素预处理抑制了这两种磷酸化，提示姜黄素通过干扰JAK2/STAT3通路激活，有效抑制了由急性肺损伤触发的炎症反应。但本研究没有对SOCS3的表达水平进行检测，笔者将在活性的研究中完善相关检测。

综上所述，本研究证实了姜黄素在小鼠急性肺损伤模型组发挥了保护作用，其作用机制可能与抑制JAK2/STAT3通路激活，减少炎症介质分泌有关。因此，笔者认为姜黄素可能具有治疗急性肺损伤的潜力。