慢性铝中毒小鼠学习记忆能力与大脑皮层乙酰胆碱和β-内啡肽关系的研究

蒙缜之 廖美爱 李婷 梁舒婷 邓凯戈 潘凤婷 王凌风 尚鹏飞 黄彦峰 黄俊杰

铝元素广泛存在于自然界，由于其良好的理化性质而被广泛应用于各个领域。随着人类接触和使用铝的情况日益增多，一定程度上增加了铝在人体的蓄积。铝是一种慢性神经毒性物质，长期接触铝可引起学习记忆功能减退、认知功能障碍等症状[1，2]，然而铝中毒损伤学习记忆的机制尚未完全明确。本研究拟通过检测铝中毒小鼠大脑皮层乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）和β-内啡肽（β-endorphin，β-EP）的含量，探讨大脑皮层ACh和β-EP在铝中毒机制中的作用，为阐明铝的神经毒性机制和后续的干预研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级昆明小鼠32只，12周龄，体重20～25g，购自右江民族医学院实验动物中心[动物合格证号：SCXK（桂）2012-0003]，雌雄分笼饲养，每笼8只。

1.1.2 主要实验试剂及仪器 三氯化铝（AlCl3，天津市大茂化学试剂厂），乙酰胆碱试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠内啡肽试剂盒（Sigma 公司）。FSH-2可调高速匀浆机（江苏省金坛市宏华仪器厂），Y 型迷宫刺激器（MG-B，张家港市教学实验器械厂），小型离心机（上海安亭科学仪器厂），大型离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组建模 取小鼠32 只，雌雄各半，随机分成低、中、高剂量染毒组和对照组，每组8 只。低、中、高剂量组用16g/L 浓度的AlCl3水溶液，每日分别按1.2mg/kg、12mg/kg、120mg/kg 剂量，拌饲料喂养，直至实验结束，连续90d；对照组普通饲料正常饲养。

1.2.2 小鼠学习记忆能力测试 小鼠的学习和记忆行为能力用Y型迷宫刺激器进行检测。Y型迷宫由3只短臂组成，以小鼠所在短臂为起步区，另两只短臂中随机选择一只为安全区，一只为非安全区。安全区灯泡开亮，铜栅无电流；起步区和非安全区灯泡不亮，铜栅有电流。控制开关打开后，安全区灯光立刻亮起，起步区和非安全区延迟2s后通电。若小鼠在灯光亮起时能成功逃向安全区，则记为“正确”，否则记为“错误”。按文献[3，4]的实验方法和标准，将小鼠达到学会标准时所需的测试次数，作为大鼠学习行为能力的检测指标。学习能力检测24h后，依照上述方法对小鼠连续进行20 次测试，记录大鼠在20次测试中的错误次数，作为小鼠记忆行为能力的检测指标。

1.2.3 样本采集及制备方法 动物断头处死，在冰台上快速取大脑皮层，一半大脑皮层放入-80℃冰箱保存，送广西壮族自治区分析测试研究中心，用于测定小鼠大脑皮层铝含量。另一半大脑皮层，用冰生理盐水漂洗置于滤纸吸干，切取组织块0.4g，置于匀浆试管中，加入生理盐水3.6ml后进行匀浆，离心（3 500r/min）10min，取上清液，制成10%的匀浆4℃冰箱保存待测。

1.2.4 大脑皮层主要观察指标 用微波消解-电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）法[5]测定大脑皮层铝的含量；ELISA法检测大脑皮层ACh和β-EP含量；用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。测试步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，各组均数间的差异性采用单因素方差分析比较，两两组间比较采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况低剂量染毒组和对照组小鼠均活泼好动，饮食无明显改变，毛色较光亮；中、高剂量染毒组小鼠活动减少，进食量减少，毛发蓬松少光泽。

2.2 小鼠Y 型迷宫实验学习和记忆检测结果Y型迷宫实验结果显示：各组间学习测试次数和记忆错误次数差异均有统计学意义（P＜0.01）。与对照组相比，中、高剂量铝中毒组学习测试次数差异均有统计学意义（P＜0.01）；与低剂量组相比，中、高剂量组学习测试次数差异均有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比，低、中、高剂量铝中毒组记忆错误次数差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与低剂量组相比，中、高剂量组记忆错误次数差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 小鼠Y型迷宫学习和记忆检测结果（±s，n=8）

表1 小鼠Y型迷宫学习和记忆检测结果（±s，n=8）

注：与对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与低剂量组比较，cP＜0.01，dP＜0.05

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组学习测试次数15.13±1.64 17.00±1.31 20.13±2.30bc 22.25±2.71bc记忆错误次数4.25±1.04 5.88±1.36a 7.88±1.46bd 10.88±2.23bc

2.3 小鼠大脑皮层铝、ACh 和β-EP 含量各组间大脑皮层铝、ACh、β-EP 含量差异均有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。与对照组相比，中、高剂量铝中毒组大脑皮层铝含量差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与低剂量组相比，中、高剂量组大脑皮层铝含量差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。与对照组相比，中、高剂量组大脑皮层ACh 含量差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与低剂量组相比，高剂量组大脑皮层ACh含量差异有统计学意义（P＜0.01）。与对照组相比，低、中、高剂量组大脑皮层β-EP含量差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与低剂量组相比，高剂量组大脑皮层β-EP 含量差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 小鼠大脑皮层铝、ACh和β-EP含量测定结果（±s，n=8）

表2 小鼠大脑皮层铝、ACh和β-EP含量测定结果（±s，n=8）

注：与对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与低剂量组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组铝(mg/kg)48.96±9.25 52.21±12.20 63.65±11.69ac 76.95±11.17bd ACh（μg/mg prot）9.92±2.28 8.24±1.72 7.58±2.15a 4.79±1.31bd β-EP(pg/ml)45.16±6.47 39.58±2.65a 36.17±7.81b 33.98±2.50bc

3 讨论

研究表明ACh 是中枢胆碱能系统重要的神经递质，是由胆碱能神经元产生的化学递质，胆碱能系统与学习记忆的形成和存储有关[6，7]。β-EP是脑组织内具有吗啡样活性的多肽，属于内源性阿片样物质，相关研究表明，血管性痴呆模型大鼠脑组织及血浆β-EP含量降低，并且其降低程度与痴呆程度密切相关[8，9]。有研究表明[10，11]，铝可导致大鼠学习记忆能力下降，认为可能与大鼠海马AMPA 受体蛋白表达水平下降、海马内CaN 的表达增加、全基因组甲基化率降低等有关，但其确切机制有待进一步研究。铝中毒引起的学习记忆障碍是否与脑内ACh和β-EP含量有关尚未明确。

本研究以饲喂含不同剂量AlCl3的饲料对小鼠染毒90d 后显示：铝暴露组Y 型迷宫实验学习训练次数和错误次数均高于对照组，且高剂量组这两项指标比低、中剂量组均升高，这说明铝中毒可致小鼠学习记忆能力下降。小鼠大脑皮层铝含量测定结果也显示，各剂量铝中毒组小鼠大脑皮层铝含量均高于对照组，且不同剂量组大脑皮层铝含量比较也有差异，铝中毒组大脑皮层铝含量增高，小鼠学习测试次数和记忆错误次数均增加，这与文献报道[12，13]一致，提示不同剂量铝暴露组引起大脑铝蓄积，导致小鼠学习记忆功能障碍。本研究结果还显示，各剂量铝中毒组大脑皮层铝含量增高，小鼠学习测试次数和记忆错误次数也增加的同时，其大脑皮层ACh和β-EP含量反而明显低于对照组，且大脑皮层内铝含量越高，小鼠学习记忆能力下降越明显，大脑内ACh和β-EP也随之明显下降，呈现一定的剂量效应关系，提示铝可能通过降低脑内ACh和β-EP的含量影响小鼠学习记忆能力，这可能是铝致小鼠认知能力障碍的机制之一，但其具体机制还有待进一步研究。