轮作不同叶菜对连作豇豆土壤养分及微生物特性的影响

倪 苗 成善汉 韩 旭 王龙飞 雷 欣 居利香 汪志伟 朱国鹏

（海南大学热带农林学院，海南海口 570228）

豇豆（Vigna unguiculateL.）在海南省冬季设施栽培的瓜菜面积中排名第二，是海南省农民重要的收入来源（刘子记 等，2016）。由于豇豆连年种植，重茬地块增多，土壤板结，肥力下降，微生物多样性降低，多种病虫害同时发生，危害严重，致使农户随意加大药量和施用频次，不仅增加了农民的种植成本，且严重威胁农产品的质量安全（吉清妹 等，2011）。土壤养分与微生物组成是衡量土壤肥力的重要指标，土壤中病原菌很难在微生物多样性高的土壤中生长、繁殖（Shiomi et al.，1999）。同一种作物的连茬种植，容易破坏土壤的微环境，降低微生物的多样性，土壤的利用能力下降，形成连作障碍（孟令波 等，2017）。研究表明，合理轮作有助于连作障碍的缓解（Larkin & Halloran，2014；喻景权和周杰，2016），如番茄和莴苣、草莓和生菜、草莓和茼蒿等轮作有助于连作障碍的缓解，改善土壤微生物条件，提高作物的经济效益（蔡伟建 等，2017）。

豇豆和叶菜轮作是海南蔬菜种植的常用模式，轮作叶菜有利于土壤肥力的保持以及土壤微生物结构的改善。本试验以出现明显连作障碍的设施大棚土壤为材料，以菜薹（菜心）（Brassica campestrisL.）、苋菜（Amaranthus tricolor）、蕹菜（空心菜）（Ipomoea aquaticaForsk）、芥菜（Brassica junceaL.）、大白菜（Brassica rapa pekinensis）为轮作作物，研究轮作前后土壤养分及微生物的变化，以期得到适宜的豇豆—叶菜轮作模式，为海南地区大棚蔬菜设施栽培的高产高效提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试蔬菜品种：夏冠2号油白豆角，购自汕头市澄海区成启种子贸易商行；春梅菜心、严选红圆叶苋菜、泰国空心菜、夏美白菜F1均购自汕头市金韩种业有限公司；特选大坪埔大肉包心芥菜购自江门利隆种业有限公司。

1.2 试验设计

试验于2017年在三亚市妙林洋设施大棚基地进行，土壤为连续6 a种植豇豆的连作地，连作障碍严重，土壤基础肥力：pH为6.40，有机质17.55 g·kg-1，全氮 0.891 g·kg-1，碱解氮 148.56 mg·kg-1，速效磷 180.24 mg·kg-1，速效钾 62.25 mg·kg-1。试验共设置6个处理，分别为轮作菜心、苋菜、空心菜、芥菜和大白菜，以连作豇豆为对照。每个处理3次重复，每处理小区长25 m，宽1.5 m，面积为37.5 m2。田间施肥与轮作管理方式如下：4月9日播种前以复合肥（N-P2O5-K2O为5-15-15，275 kg·hm-2）作基肥，4月28日在豇豆的结荚初期及叶菜的生长盛期追肥1次；5月13日叶菜采收后，清除植株残体，整地后于5月17日播种第2茬叶菜，并于6月3日豇豆的盛收期进行第2次追肥，追肥的肥料种类、用量与基肥一致，豇豆与叶菜在6月23日全部采收结束。

1.3 土样采集

蔬菜全部收获后按5点取样法选取菜根附近的土壤采样点，用直径5 cm的土钻采集0～20 cm处表土。并将混匀后的土壤样品分成2份，一份放置于阴凉通风处自然风干，并过筛用于土壤养分的测定，一份鲜样于-80 ℃保存，用于土壤微生物检测与分析。

1.4 土壤养分测定

土壤基本养分的测定采用常量分析法（鲍士旦，2000），其中pH测定采用pH计法（电位）；全氮含量测定采用半微量凯氏法；碱解氮含量测定采用碱解扩散法；土壤有机质含量测定采用重铬酸钾容量法-外加热法；有效磷含量测定采用氟化铵-盐酸提取-钼锑抗比色法；速效钾含量测定采用1 mol·L-1乙酸铵浸提-火焰光度法。

1.5 土壤微生物多样性分析

1.5.1 土壤样本DNA提取及PCR扩增 分别称取各处理土壤样本，用土壤基因组DNA提取试剂盒HiPure Soil DNA Kits（Magen公司）按说明书步骤提取土壤中的DNA。按指定测序区域设计特异引物，对细菌16S rDNA V4+V5区域进行PCR扩增，引物为515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）与907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）（许颖等，2016）；真菌引物为ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′） 与ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）（Yang et al.，2016）。PCR扩增利用GeneAmp PCR System 9700型PCR仪，采用PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa公 司 ），20μL反应体系：10 μL 5× PrimeSTAR Buffer（含Mg2+）；4 μL 2.5 mmol·L-1dNTP Mixture；正反向引物各 1 μL（5 μmol·L-1）；0.4 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase；10.0 ng模板DNA，补足ddH2O至20 μL。PCR反应程序：98 ℃ 1 min；98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 30 s，27个循环；72 ℃延伸5 min。使用Axy-Prep DNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）对PCR产物进行切胶回收，Tris-HCl洗脱。

1.5.2 测序 用illumina MiSeq测序仪与illumina建库试剂盒对得到的片段建库测序，测序策略为PE250。

1.6 数据处理

1.6.1 试验数据 利用SPSS 19.0和Excel 2013软件进行分析统计作图。

1.6.2 土壤微生物多样性分析 采用高通量测序技术，检测细菌基因V4+V5区域、真菌基因ITS区域。对PCR产物进行测序，拼接成tag，并根据tag进行物种分类、OTU分析、多样性分析等。用Mothur（v.1.34.0）软件将细菌16S rDNA测序及真菌ITS测序所得tags进行OTU（operaing taxonomic unit）聚类，得各样本0.03距离（97%相似度）OTU数量。Alpha多样性采用Mothur（v.1.34.0）软件、基于OTU结果对单个样本内的物种多样性进行分析，包括Chao1值、Ace值以及Shannon指数等（Kemp & Aller，2004）。Chao1值、Ace值是根据细菌16S rDNA测序或真菌ITS测序所得tags数和OTU的数量以及相对比例来预测样本中细菌或真菌的种类，是基于已知结果所得的相对值（高琳 等，2016）。Shannon指数：抽样n个tags计算Shannon指数的期望值。

最佳分类水平的确定：首先统计出各分类水平上的tag序列数，用以确定样本微生物的最佳物种分类水平。

最佳分类水平上的物种分布堆叠图：分析软件为R语言Ggplot2包。基于以上确定的最佳分类水平进行绘制，以堆叠图的形式直观展示不同样本在最佳分类水平上的物种丰度的变化情况。为了使展示画面美观，本试验中只展示至少在一个样本中的表达丰度达到2%的物种。

2 结果与分析

2.1 不同轮作处理对土壤养分的影响

由表1可知，不同轮作处理的土壤pH发生了改变，轮作苋菜、芥菜和大白菜处理显著高于对照，但各处理土壤还是处于酸性土壤的状态。轮作苋菜处理的土壤有机质含量显著高于其他处理，比对照提高20.92%，轮作大白菜处理的含量最低，比对照降低8.83%，轮作苋菜、空心菜、菜心可以提高土壤有机质含量。各处理的土壤全氮含量均与对照无显著差异。各轮作处理的土壤碱解氮含量都显著高于对照，其中轮作苋菜与芥菜处理较高。轮作苋菜处理的土壤速效磷含量显著高于对照和其他处理，比对照增加了28.74%。各处理的土壤速效钾含量差异不显著。

2.2 不同轮作处理对土壤微生物丰度与多样性的影响

Ace值是用来估计群落中含有OTU数目的指数，使用Chao1算法估算群落中所含OTU数目，其中，Ace、Chao1和OTU的数值越大代表样本中所含物种越多；Shannon指数用于评估样本中物种组成的多样性，数值越大表示该环境的物种越丰富，多样性越高（Pennisi，2004；Pitta et al.，2014；Sun et al.，2015）。通过高通量测序结果可知（表2），各处理细菌的OTU数与对照相比都有所上升，其中轮作苋菜与芥菜处理较高，显著高于对照；各处理细菌群落的Ace值与Shannon指数与对照差异不显著，轮作苋菜与菜心处理的Chao1指数显著高于对照；上述结果表明各处理对土壤的细菌多样性影响不大，但轮作处理提高了土壤细菌群落的丰度。真菌群落多样性指数在不同处理下存在明显差异，各处理的真菌OTU数均高于对照，其中轮作苋菜与芥菜处理与对照差异显著；Ace值与Chao1指数各处理之间无显著差异，而轮作苋菜处理的Shannon指数显著高于对照，轮作芥菜和大白菜处理次之；表明轮作处理对土壤真菌群落的丰度影响不大，但能提高土壤真菌的多样性。

表1 不同轮作处理对土壤养分的影响

表2 不同轮作处理对土壤微生物丰度与多样性的影响

2.3 不同轮作处理对土壤微生物群落结构的影响

2.3.1 土壤细菌群落结构变化 由图1可知，处理土壤共有20个优势细菌目（相对丰度＞1%，其余为others），包括Acidobacteriales（酸杆菌目 ）、Actinomycetales（放线菌目）、Bacillales（芽孢杆菌目）、Burkholderiales（伯克氏菌目）、Cytophagales（噬纤维菌目）、Lactobacillales（乳杆菌目）、Myxococcales（黏球菌目）、Nitrospirales（硝化螺旋菌目）、Rhizobiales（根瘤菌目）、Rhodospirillales（红螺菌目）、Saprospirales（腐生螺目）、Syntrophobacterales（互营杆菌目）、Xanthomonadales（黄色单胞菌目）等。不同轮作处理影响了土壤细菌群落组成，如喜酸性菌Acidobacteriales在轮作空心菜处理中含量最高，对照次之，而轮作苋菜处理含量最低；Bacillales是对病原菌有拮抗作用的有益细菌，Nitrospirales具有硝化的作用（Pennisi，2004），这2种有益菌在轮作苋菜处理中的含量分别比对照提高了9.06%、34.1%。Actinomycetales的含量表现为对照低于各轮作处理，而Rhizobiales的含量则反之。

2.3.2 土壤真菌群落结构变化 由图2可知，处理土壤共有8个优势真菌属（相对丰度＞1%，其余为others），包括：Aspergillus（土曲霉属）、Chaetomium（毛壳菌属）、Cladosporium（枝孢属）、Fusarium（镰孢菌属）、Myceliophthora（毁丝霉属）、Penicillium（青霉属）、Sordaria（粪壳属）、Thielavia（梭孢壳属）。不同轮作处理影响了土壤真菌群落组成，除了大白菜轮作处理，对照中的Fusarium丰度明显高于各轮作处理。轮作苋菜与芥菜处理的Penicillium和Sordaria含量明显高于对照。

图1 不同轮作处理下土壤细菌目水平的群落结构

图2 不同轮作处理下土壤真菌属水平的群落结构

3 讨论

3.1 不同轮作处理对豇豆连作地的土壤养分影响

土壤酸化是连作障碍发生的主要原因之一，因此提高土壤的pH或减缓土壤的酸化成为克服连作障碍的重要措施之一（肖新 等，2015）。研究表明，茄子和香蕉轮作可以在一定程度上提高连作土壤pH和土壤有机质含量，减轻连作带来的危害（洪珊，2017）。本试验条件下，轮作苋菜可以显著提高连作豇豆土壤的pH值，有机质含量显著提高20.92%，但土壤全氮含量与对照差异不显著，可能是由豇豆根瘤菌的固氮作用所致。在速效养分方面，郑超等（2003）认为合理的轮作模式可以增加土壤有机质和土壤养分含量，加速速效养分的释放。本试验中，叶菜轮作处理的土壤速效养分比对照有所增加，其中轮作苋菜处理后土壤的碱解氮、速效磷含量最高，均显著高于对照。

3.2 不同轮作处理对豇豆连作地微生物特性的影响

土壤微生物生物量是衡量土壤质量、维持土壤肥力和作物生产力的一个重要指标（Wang et al.，2015）。研究表明，长期种植单一作物容易导致土壤中养分失衡（姜佰文 等，2014），作物根际微环境破坏（顾大路 等，2016），微生物群落结构改变（Kintché et al.，2015）。通常，土壤中微生物多样性增加有利于提高土壤的多功能性和可持续性（Wagg et al.，2014）。孟令波等（2017）研究表明，芥菜与茄子轮作后的土壤微生物群落结构发生了变化，轮作后土壤中有益细菌丰度增加，缓解了茄子连作障碍，能够有效防控茄子的土传病害。本试验中，不同轮作处理影响了土壤微生物的群落结构与微生物多样性，轮作苋菜和芥菜后，土壤细菌OTU数和Chao1指数明显高于连作土壤，说明轮作苋菜和芥菜有助于提高土壤细菌的丰度。研究发现，土壤中Actinomycetales细菌可以抑制土传病原体繁殖，克服连作导致的土传病害和土壤酸化等弱化作用。本试验中各轮作处理的土壤中Actinomycetales相对丰度都有所上升，说明轮作能一定程度减缓土壤的连作危害（应益昕，2013）。Acidobacteriales与土壤pH呈负相关，喜酸性土壤（Griffiths et al.，2011）。本试验结果显示，除了与空心菜轮作后Acidobacteriales的丰度发生了上升，其余各处理都发生了不同程度的下降，同时发现各处理的Acidobacteriales相对丰度与各处理的土壤pH成负相关，轮作苋菜后Acidobacteriales丰度最低表明轮作苋菜减缓了土壤的酸化。同时对照Rhizobiales的丰度高于各轮作处理，可能是因为豆科植物的根瘤菌在植株生长期间发挥了一定的作用。

不同叶菜轮作后土壤细菌群落发生了变化，同时真菌群落结构也发生了改变。本试验在MiSeq高通量测序结果中共鉴定出8个优势真菌菌属（图2）。赵娜等（2014）的盆栽试验结果表明，与茄子轮作能显著降低枯萎病蕉园土壤中Fusarium的数量。本试验中，与豇豆连作相比，除了与大白菜轮作后Fusarium含量出现了上升，其他处理的土壤Fusarium丰度均降低，有利于减缓土传病带来的危害。赵存鹏等（2017）发现粮棉轮作可以增加土壤中Sordaria的丰度，提高土壤肥力；王芳等（2013）研究表明Penicillium对尖孢镰刀菌具有较好的抑制作用。本试验中，Sordaria和Penicillium在轮作苋菜和芥菜后出现了明显的上升，表明苋菜轮作提升了有益菌的丰度，提高了微生物多样性，与番茄轮作的研究结果相类似（杨尚东 等，2016）。

4 结论

本试验结果表明，豇豆轮作叶菜不仅能够提高土壤肥力，而且能够提高土壤细菌群落的丰度和真菌群落的多样性，有利于保持土壤微生物群落结构的稳定。在菜心、苋菜、空心菜、芥菜和大白菜5种叶菜中，苋菜轮作对豇豆连作土壤的肥力及微生物群落结构改善效果最好。