低频电针对紫杉醇诱发周围神经痛大鼠背根神经节TRPV1表达的影响

李园园李清林尹诚语台燕刘伯宇胡奇妙项璇儿郑小莉刘伯一方剑乔

1.浙江中医药大学第三临床医学院 杭州 310053 2.浙江省肿瘤医院3.浙江中医药大学中医药科学研究院

随着全球恶性肿瘤发病率的不断上升，抗肿瘤药物的临床应用日益增多。如紫杉醇（paclitaxel,PTX），作为临床常用的化疗药物，从红豆杉中提取，通过促进细胞内微管蛋白聚合保持其稳定，进而抑制肿瘤细胞增殖[1]，广泛应用于实体瘤如乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的化学治疗[2]。化疗诱导的周围神经痛是化疗药物最常见的不良反应。紫杉醇等化疗药物诱发的周围神经病变（chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN）表现为手足疼痛感或麻木等症状，对镇痛药具有抵抗力，是一种难治性痛症[3]。由于对其机制缺乏深入研究，目前尚无疗效显著的治疗措施。因此，寻找能有效干预紫杉醇诱发 CIPN的方法并阐明其机理，是现在急切需要解决的问题。

瞬时感受器电位香草酸受体1型（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）属于瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP） 离子通道家族的瞬时感受器电位香草酸受体（transient receptor potential vanilloid，TRPV）家族，主要在中、小直径背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）神经元中表达[4-5]，是一类与疼痛密切相关的离子通道，是生理病理性疼痛的关键因素[6-7]。有研究报道，在外周神经损伤模型[8-9]中，如紫杉醇诱发的CIPN大鼠模型，大鼠DRG神经元中TRPV1的表达上调[10-12]。应用TRPV1拮抗剂、华蟾素等可通过抑制大鼠DRG中TRPV1的过表达逆转紫杉醇诱导的机械痛过敏[11-12]。

电针（electroacupuncture，EA）是目前公认的有效控制疼痛的重要手段之一，具有副作用小、价格便宜、临床易于推广的优点，广泛应用于各类急慢性疼痛的治疗。实验研究证明低频电针可抑制TRPV1的活化，并且对于周围神经痛具有较优镇痛效应[14-16]，如紫杉醇诱发CIPN[17-18]，但其机制是否与干预DRG中TRPV1过表达有关，目前尚未有明确报道。本实验拟通过建立紫杉醇诱导的周围神经痛大鼠模型，观察造模后大鼠右足足底机械缩足反应阈值（paw withdrawal thresholds，PWTs）的变化。采用电针干预及免疫荧光方法，通过观察低频电针对紫杉醇诱发 CIPN大鼠模型疼痛行为学变化以及对 DRG中 TRPV1表达的干预作用，探讨低频电针治疗紫杉醇诱发大鼠 CIPN的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠42只，体质量200～220g，购自中国科学院上海实验动物中心，由浙江中医药大学实验动物中心饲养，许可证号：SCX（沪）2008-0016。饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料（由实验动物中心提供）及自由饮水，12h循环灯光，室温（23±2）℃。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要试剂及仪器 药用级紫杉醇（安素泰，澳大利亚），兔抗大鼠Anti-VR1多克隆抗体（美国Abcam，产品货号：ab6166），驴抗兔 IgG H&L（美国 Abcam，产品货号：ab150061），其余试剂均为市售分析纯级。纤毛机械刺激针（von Frey Hairs test触觉纤维丝，美国 stoelting），韩式穴位神经刺激仪（型号：HANS-200A，联创科技南京济生医疗科技有限公司），全能台式高速冷冻离心机（型号：Sorvall Biofuge Stratos，美国 Thermo Scientific公司），Thermo冰冻切片机（型号：HM550，美国 Thermo Scientific公司），激光共聚焦显微镜（型号：NiKON Elements AR，日本Nikon公司）。

1.3 方法

1.3.1 分组 用于建立模型的14只大鼠完全随机分为2组：溶剂组、紫杉醇组，每组7只；用于研究电针干预紫杉醇诱发 CIPN及 TRPV1通道表达的28只大鼠完全随机分为溶剂组、紫杉醇组、紫杉醇+电针组、紫杉醇+假电针组，每组7只。

1.3.2 动物模型制备 参照已有学者成功制备大鼠紫杉醇诱导大鼠神经病理痛模型的方法[19,20]，将药物级紫杉醇用0.9%无菌盐水从原液浓度6mg/ml稀释至1mg/ml，并且以2mg/kg的剂量每隔1天腹腔（i.p.）给药，共进行 4 次注射（第 1、3、5、7d），达到最终累积剂量为8mg/kg，建立 CIPN模型。溶剂组仅接受等量无菌生理盐水。

1.3.3 治疗干预 溶剂组、紫杉醇组不做任何电针处理。紫杉醇+电针组：第10d，介入电针干预，选取双侧“足三里”和“昆仑”穴（参照华兴邦大鼠穴位图谱）[21]，采用0.18mm×13mm毫针，进针后连接“LH-200A韩氏穴位暨神经刺激仪”，治疗参数：波形为连续波，频率 2Hz，强度 0.5～1.5mA（开始 0.5mA，每 10min 增加0.5mA），共 30min，1次/d，至实验结束。紫杉醇+假电针组：选穴及干预时间同电针组，进针至皮下不超过2mm深度，连接“LH-200A韩氏穴位暨神经刺激仪”，不开机，持续30 min，1次/d，至实验结束。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 PWTs检测 参照参考文献[22]，第一部分于大鼠第 0、2、4、6、8、15 和 22d 时间点 PWTs 作为痛阈指标；第二部分于大鼠第 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18d时间点PWTs作为痛阈指标。测量前，先将大鼠置于铁丝网上透明有机玻璃罩（20cm×20cm×15cm）内，适应环境30min。待其安静后，选取0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0 g 总计 11 种强度的von Frey丝，最先使用4.0g强度的von Frey丝进行检测。von Frey丝对准大鼠右侧后足足底（避开足垫），缓慢上抬von Frey丝，至纤维丝弯曲成S形，连续刺激5s。如大鼠未产生逃避反应，记为“O”并换取高一个强度的纤维丝刺激，直至大鼠产生逃避反应。如大鼠产生逃避反应，记为“X”并换取低一个强度的纤维丝刺激，直至大鼠不产生逃避反应。连续进行6次测量，每次刺激间最小间隔2min。记录大鼠一系列反应。按如下公式进行痛阈计算：50%PWTs(g)=10^（xf+κ*δ-4）。公式中各值含义为：Xf代表最后一次测量的von Fery丝强度，κ值代表up and down法中阳性（X）/阴性（O）反应参数表内参考值，查表后获得，δ为各个强度 von Frey丝力度取对数后差值的平均值，在此约等于0.185。设定最大刺激强度26g，最小刺激强度为0.4g。若计算得出50%PWTs大于26.0g或小于0.4g，仍以26.0g或0.4g作为最大或最小值。行为学测量时间固定在9:00-16:00，环境温度：23±2℃。

1.4.2 取材及样本处理 第一部分实验于第22d；第二部分实验于第18d，完成痛阈测量后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，注射剂量为0.35ml/100g。开胸暴露心脏，经升主动脉快速灌注4℃生理盐水，快速推注4%多聚甲醛约150ml，再予4%多聚甲醛缓慢滴注15min左右，待大鼠肢体僵硬，快速取出L4-6 DRG，放入含有4%多聚甲醛的 EP管内，固定3h，依次置于15%（24h，沉底）、30%（48h，沉底）蔗糖溶液脱水，液氮速冻，-80℃保存。

1.4.3 免疫荧光染色 用冷冻切片机进行冷冻冠状位连续切片，采用贴片法，切片厚度10μm,每6个层次取1张切片，每只大鼠一个节段DRG切取10张玻片，随机取4张荧光图片进行荧光统计。切片滴加5%正常山羊血清 37℃封闭1h，滴加一抗（兔抗大鼠TRPV1 ab6166，1:400）4℃孵育过夜，滴加二抗（驴抗兔 ab150061，1:600）37℃避光孵育 1h，滴加抗荧光淬灭封片液（美国Abcam,产品货号:ab104139），盖玻片封片。激光扫描共焦荧光显微镜下观察并摄片用Nikon Elements AR Analysis软件（Nikon公司）进行阳性细胞及直径大小的计数。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0对数据进行统计分析，所有资料采用±s表示。两组间比较采用独立样本Student’s t检验，多组间比较采用重复测量方差分析和单因素方差分析（ANOVA），两两比较，方差齐性时采用最小显著性差异法（Least—Significant Difference，LSD）检验，方差不齐时采用 Dunnett’s T3检验，均以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫杉醇对大鼠50%PWTs的影响 如图1A所示进行模型建立和实验观察。如图1B所示，紫杉醇溶液注射前，各组大鼠 50%PWTs比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。造模后1d，与溶剂组相比，紫杉醇组大鼠50%PWTs下降（P＜0.01），并且随着时间的推移持续下降到第21d（P＜0.01）。而溶剂组大鼠阈值保持稳定没有下降。图1C所示曲线下面积也显示紫杉醇造模后，两组大鼠出现显著差异（P＜0.01）。以上结果说明紫杉醇诱导周围神经痛模型造模成功。

2.2 紫杉醇对大鼠 L4-6 DRG神经元TRPV1表达的影响 如图2A及2B所示，造模后，紫杉醇组大鼠右侧L4-6 DRG中TRPV1表达阳性神经元个数相比溶剂组出现增多现象。图2B为图2A细胞个数统计图，统计后数据显示，与溶剂组相比，紫杉醇组大鼠右侧L4-6 DRG中TRPV1表达阳性神经元个数显著增多（P＜0.01）。图2C表明紫杉醇组增多的TRPV1阳性表达神经元主要集中于中、小直径 DRG神经元。

2.3 电针对紫杉醇诱发大鼠CIPN的干预作用 如图3A所示，进行模型建立和实验观察。图3B显示造模前各组大鼠50%PWTs比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。图3B显示造模后，与溶剂组相比，紫杉醇组、紫杉醇+电针组、紫杉醇+假电针组50%PWTs显著下降（均P＜0.01）。电针干预后，与紫杉醇+假电针组相比，紫杉醇+电针组50%PWTs上调（P＜0.01）。紫杉醇+假电针组50%PWTs与紫杉醇组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。图3C所示的曲线下面积统计图与图3B结论一致。

2.4 低频电针对紫杉醇诱发CIPN大鼠L4-6 DRG神经元TRPV1过表达现象的干预作用 如图4A所示，电针干预后，紫杉醇组大鼠右侧L4-6 DRG中TRPV1阳性表达细胞较溶剂组增多；紫杉醇+电针组大鼠右侧L4-6 DRG中TRPV1阳性表达细胞较紫杉醇+假电针组、紫杉醇组减少；图4B为4A统计图，与溶剂组相比，紫杉醇组大鼠右侧L4-6 DRG中TRPV1阳性表达细胞显著增多（P＜0.01）。与紫杉醇组+假电针组相比，紫杉醇+电针组大鼠右侧 L4-6 DRG中TRPV1阳性表达细胞显著减少（P＜0.01）。而与紫杉醇组相比，紫杉醇+假电针组大鼠右侧L4-6 DRG中TRPV1阳性表达细胞表达无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。图4C表明电针可以显著减少紫杉醇所导致的TRPV1在中小直径 DRG神经元中的过表达作用。

3 讨论

图1 紫杉醇对大鼠不同时间点50%PWTs的影响Fig.1 The effects of paclitaxel on 50%PWTs at different time points in rats

化疗诱发的周围神经痛是抗癌治疗中常见并发症，其主要症状为感觉异常、麻木和疼痛，目前缺乏有效的预防和治疗措施，严重影响患者的生活质量[23]。在所有化疗药物中，紫杉醇诱发周围神经病变的发病率为60%～70%[24]。本实验结果显示，隔天腹腔注射2mg/kg紫杉醇，紫杉醇组大鼠右侧50%PWTs均显著下降，且在整个实验期间均维持在较低水平，与溶剂组相比差异具有统计学意义，表明成功建立大鼠周围神经痛模型。该结果与以往研究结果相一致[19,25]。

现代研究表明，电针对慢性痛具有良好的镇痛效果[26-27]，而低频电针不仅通过抑制TRPV1的活化治疗神经痛[15-16]，对紫杉醇诱发CIPN同样具有治疗作用[17-18]。本实验结果显示，造模后进行电针干预，紫杉醇+电针组大鼠的50%PWTs相对紫杉醇组明显升高，且差异具有统计学意义。因此，表明低频电针干预可降低紫杉醇诱发CIPN的机械痛痛觉过敏，这一结果与以往报道相一致[17-18]。

图2 各组大鼠右侧L4-6 DRG神经元 TRPV1表达水平（免疫荧光，10x）（±sem）Fig.2 The expression of TRPV1 in L4-6 DRGs neurons in the right lumbar of each group(immunofluorescence,10x)

TRPV1是一种与疼痛密切相关的非选择性阳离子通道，它同时参与了慢性痛外周敏化和疼痛中枢调制[28]。大量研究表明，TRPV1参与紫杉醇诱发CIPN的痛觉过敏[11,29]。以往研究表明，疼痛模型大鼠的小直径DRG神经元中TRPV1的表达增加[30]。本实验发现，紫杉醇造模后18d及22d，紫杉醇大鼠右侧DRG中TRPV1表达明显高于溶剂组。免疫组织化学分析表明紫杉醇大鼠的中、小直径DRG神经元中TRPV1表达显著增加。该结果提示，中、小直径 DRG神经元中TRPV1的上调可能介导紫杉醇诱发CIPN的机械痛痛觉过敏。本实验发现紫杉醇+电针组大鼠右侧DRG中TRPV1的表达明显低于紫杉醇组、紫杉醇+假电针组。以上结果表明，低频电针可有效抑制中、小直径DRG神经元TRPV1的过表达。以往研究表明抑制脊髓背角中TRPV1的活化可介导电针治疗炎性痛和神经病理痛[31]，但并不清楚抑制DRG中TRPV1的上调是否介导低频电针治疗CIPN以及电针是否通过其他通路调控 TRPV1的表达。已有研究表明TLR4参与紫杉醇诱发CIPN[32]，并可增强感觉神经元中TRPV1的活化[33]，并在DRG神经元中共定位，使用TLR4抑制剂，可降低DRG中TRPV1的过表达，并逆转已经出现的痛觉过敏[34-36]。因此，DRG中TLR4可能通过诱导TRPV1的高表达及活化进而参与调节紫杉醇诱发CIPN。

图3 电针治疗后，紫杉醇对大鼠不同时间点50%PWTs的影响Fig.3 The effects of 2Hz EA or Sham EA treatment on 50%PWTs of rat CIPN model

本研究从低频电针干预CIPN的角度出发，深入探讨了低频电针对CIPN产生的干预作用的可能机制，通过观察低频电针对DRG中TRPV1过表达的干预作用，探索电针干预CIPN的外周神经调节机制。综上研究发现可知，低频电针可以有效缓解CIPN，使50%PWTs升高，其作用机制可能与其下调中、小直径DRG神经元中TRPV1的过表达水平有关，但低频电针是否通过TLR4-TRPV1通路干预紫杉醇诱发CIPN的深层次机制有待进一步研究，这一研究将有助于为针灸治疗CIPN提供可能靶点，揭示低频电针治疗CIPN的机制，并为推动电针进一步应用于CIPN的临床治疗提供理论依据。

图4 电针治疗后，各组大鼠右侧L4-6 DRG神经元TRPV1表达水平变化（免疫荧光，10x）（±sem）Fig.4 Effect of 2Hz EA or Sham EA on expression of TRPV1 in L4-6 DRGs neurons in the right lumbar of each group(immunofluorescence,10x)