HPLC 法同时测定温肾养肝颗粒中4 种成分

胡 玮， 顾丽亚， 周亚萍， 毛春芹， 陆兔林， 谈瑄忠∗

（1. 南京市中医院， 江苏 南京 210001； 2. 南京中医药大学药学院， 江苏 南京 210023）

温肾养肝颗粒由肉苁蓉、 乌药、 白芍、 山药、钩藤、 益智仁6 味药材组成， 具有温肾助阳、 柔肝益气之功效， 为南京市中医院临床经验方， 主要用于治疗肾阳虚衰、 肝血不足、 脾虚气弱型帕金森氏病非运动症状[1-2］。 方中肉苁蓉为君药， 补肾益精， 主要成分为苯乙醇苷类， 以松果菊苷和毛蕊花糖苷为代表[3-6］， 具有抗氧化、 调节免疫、 延缓衰老的作用[6］； 乌药抗炎镇痛， 去甲异波尔定是其主要药效成分[7］； 白芍具有明显的免疫调节、 镇静活性， 其主要成分为芍药苷， 对惊厥有拮抗作用[8］。 本实验建立HPLC 法同时测定温肾养肝颗粒中上述4 种成分的含有量， 以期为该制剂临床用药安全、 质量可控提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695 型高效液相色谱仪， 配置Waters 2998 检测器、 Empower 色谱工作站（美国Waters 公司）； Milli-Q Intergral 纯化系统 （美国Millipore 公司）； MS105DU 型电子分析天平（十万分之一， 瑞士Mettler-Toledo 公司）； FA1104 型电子分析天平（万分之一， 上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 试药 去甲异波尔定 （批号 111825-201402）、 松果菊苷（批号111670-201706）、 芍药苷（批号110736-201741）、 毛蕊花糖苷 （批号111530-201512） 对照品均购自中国食品药品检定研究院。 温肾养肝颗粒 （批号180825、 180826、180827， 8 g／袋） 由南京市中医院提供。 磷酸为分析纯； 乙腈为色谱纯； 水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[9-10］AkzoNobel Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流动相乙腈（A） -0.2%磷酸（B）， 梯度洗脱（0 ～30 min， 15% ～85%A； 30 ～33 min， 35% ～65% A； 33 ～40 min，15% ～85%A）； 体积流量1.0 mL／min； 柱温30 ℃；检测波长238 nm （去甲异波尔定、 芍药苷）、330 nm （松果菊苷、 毛蕊花糖苷）； 进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，加甲醇制成每1 mL 分别含去甲异波尔定、 松果菊苷、 芍药苷、 毛蕊花糖苷0.413、 1.069、 2.036、0.294 mg 的贮备液， 精密量取适量， 置于5 mL 量瓶中， 甲醇定容， 摇匀， 制成每1 mL 分别含四者0.082 6、 0.213 8、 0.407 1、 0.058 7 mg， 即得。

2.3 供试品溶液制备 取1 袋颗粒， 研细， 精密称取2 g 粉末， 置于具塞锥形瓶中， 精密加入25 mL 50%甲醇， 密塞， 称定质量， 超声（100 W、40 kHz） 30 min， 放冷， 50% 甲醇补足减失的质量， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 即得[4］。

2.4 阴性样品溶液 按处方和工艺， 分别制备缺肉苁蓉、 乌药、 白芍阴性样品， 按“2.3” 项下方法制备， 即得。

2.5 专属性试验 吸取对照品、 供试品、 阴性样品溶液适量， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。 由图可知， 各成分分离度良好 （＞1.5）， 阴性无干扰， 表明方法专属性良好。

2.6 线性关系考察 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 mL， 置于1 mL 量瓶中， 甲醇稀释至刻度， 摇匀， 在“2.1”项色谱条件下进样测定。 以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X） 进行回归， 结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.7 精密度试验 精密吸取对照品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次， 测得去甲异波尔定、 松果菊苷、 芍药苷、 毛蕊花糖苷峰面积RSD 分别为1.7%、 2.5%、 2.3%、 2.8%， 表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液 （批号180826）， 于0、 3、 6、 9、 12、 24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 测得去甲异波尔定、 松果菊苷、 芍药苷、 毛蕊花糖苷峰面积RSD 分别为1.1%、 2.3%、 1.9%、 1.3%， 表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.9 重复性试验 取同一批颗粒（批号180826）6 份， 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 测得去甲异波尔定、 松果菊苷、 芍药苷、 毛蕊花糖苷含有量RSD分别为2.4%、 1.3%、 2.1%、 1.6%， 表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取各对照品适量，制成每1 mL 分别含去甲异波尔定、 松果菊苷、 芍药 苷、 毛 蕊 花 糖 苷 0.493、 1.281、 2.443、0.369 mg的对照品溶液。 再将颗粒（批号180826）研细， 精密称取9 份粉末， 每份1 g， 均分为3 组，置于具塞锥形瓶中， 分别加入对照品溶液0.8、1.0、 1.2 mL， 按“2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样10 μL 测定， 计算回收率， 结果见表2。

2.11 样品含有量测定 取3 批颗粒， 每批精密称取2 g， 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 计算含有量， 结果见表3。

表3 各成分含有量测定结果（mg／g， n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg／g， n=3）

3 讨论

3.1 检测波长选择 本实验对对照品溶液进行扫描（200～400 nm）， 发现在330 nm 波长处松果菊苷、 毛蕊花糖苷有最大吸收， 而在238 nm 波长处芍药苷、 去甲异波尔定响应值较高， 峰形理想。

3.2 流动相选择 参照文献[9-15］， 本实验比较了 甲 醇-水、 乙 腈-三 乙 胺、 甲 醇-磷 酸、 乙 腈-0.1% ／0.2%磷酸、 甲醇／乙腈-甲酸等流动相， 发现乙腈-0.2% 磷酸分离效果较好， 可达到分离度要求。

3.3 样品处理方法选择 参考文献[9-15］， 本实验比较了不同体积分数甲醇（50%、 70%、 80%）和乙醇（50%）， 发现50% 甲醇提取时峰形较好，杂质较少。 然后， 比较了不同提取方式（超声、回流） 和提取时间（20、 30、 40 min）， 发现超声30 min 时即可提取完全。