五味子甲素对人胰腺癌细胞株AsPc-1增殖、凋亡的影响及其机制

曾智锐，雷珊，张金娟，杨宇石，兰金芝，陈腾祥，

(1 贵州医科大学基础医学院，贵阳550004；2 贵州医科大学临床医学院；3 贵州医科大学贵州省再生医学重点实验室)

胰腺癌是常见消化系癌症之一，恶性程度和致死率极高[1]。目前，胰腺癌的治疗主要是手术联合化疗等综合治疗，但其复发率极高，疗效较差[2]。因此，寻找新的治疗方式及药物对胰腺癌的治疗有着重要的意义。五味子甲素是我国传统中草药五味子的提取物，具有抗炎、扩血管以及免疫抑制等作用。近年来研究[3]发现，五味子甲素可以抑制卵巢癌细胞的增殖，诱导其凋亡，是卵巢癌潜在的治疗药物。然而，五味子甲素对胰腺癌是否有相应的作用，目前还没有相关研究。β-catenin蛋白是E-钙黏蛋白家族成员之一，在肿瘤细胞中常表达上调，并转位入核，作为转录因子调控肿瘤相关基因的异常表达。研究[4]结果显示，β-catenin的下游靶基因有Myc、P21、Bcl2，其通过上调这些基因的转录表达，可增强肿瘤细胞增殖能力。β-catenin还可以调控E-cadherin蛋白、金属蛋白酶家族成员MMP-7的表达，促进肿瘤细胞的细胞侵袭和迁移。研究[5]发现，β-catenin蛋白相对分子量大小约为92 kD，而进入细胞核的β-catenin可以进一步被水解成分子量大小约为78 kD的β-catenin蛋白水解片段，该水解片段具有比全长的β-catenin蛋白更高的转录活性,在肿瘤的发生发展中具有重要作用。2016年9月3日～2018年11月20日，本研究观察了五味子甲素对人胰腺癌细胞AsPc-1增殖、凋亡的影响，并探讨五味子甲素对胰腺癌细胞的调控机制。

1 材料与方法

1.1 五味子甲素、细胞及试剂 五味子甲素(纯度>98%)购自武汉慧诚益通生物公司。人胰腺癌细胞株AsPc-1购自ATCC细胞库。RPMI1640培养基、FBS血清购自Gibco公司，兔多克隆Bcl-2、bax、β-catenin抗体购自武汉三鹰技术有限公司，凋亡检测试剂盒购自Minipore生物公司，CCK8检测液、山羊抗鼠和山羊抗兔二抗购自武汉博士德生物有限公司，曲拉通破膜液、BSA封闭液、山羊抗兔-CY3荧光二抗和抗荧光淬灭封片剂购自武汉塞维尔有限公司，ECL超敏曝光液购自武汉聚能生物有限公司。

1.2 五味子甲素药液配制与细胞培养 五味子甲素溶于水，以PBS配制成5 mmol/L的母液，过滤除菌后，4 ℃保存备用。AsPc-1细胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素的RPMI1640培养基中，在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，隔天换液，待细胞融合度达75%～80%时，用0.25%的胰酶消化、传代，取状态良好的细胞用于实验。

1.3 不同浓度五味子甲素对AsPc-1细胞增殖的影响观察 ①采用CCK-8法测算细胞增殖率。AsPc-1细胞以5 000个/孔铺入到96孔板中，在37 ℃、5% CO2的培养箱中过夜，待细胞贴壁后，将AsPc-1细胞分为5组，分别加入12.5、25、50、100 μmol/L的五味子甲素药液和等量培养基，记为12.5 μmol/L组、25 μmol/L组、50 μmol/L组、100 μmol/L组(观察组)和对照组，每组设6个复孔。各组继续培养48 h后弃掉培养基，加入含有10 μL CCK-8检测液的新鲜培养基100 μL继续培养2 h，以只加入含有10 μL CCK8检测液的新鲜培养基100 μL的孔为空白组，在酶标仪450 nm处检测各孔的OD值，计算各组细胞增殖率。各组细胞增殖率=(观察组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。实验重复3次，取平均值。②采用细胞平板克隆实验检测各组细胞克隆形成能力。AsPc-1细胞以800个/皿接种于培养皿中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养1 d，待细胞完全贴壁，分别加入100 μmol/L五味子甲素药液和等体积PBS，记为五味子甲素组和对照组。各组继续培养9 d，弃培养基，PBS洗涤3次，多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，结晶紫染色20 min，PBS洗掉残余结晶紫染料，拍照后计算每个小皿形成的克隆数，以克隆数表示细胞克隆形成能力。实验重复3次，取平均值。

1.4 五味子甲素对AsPc-1细胞凋亡的影响观察 采用流式细胞术。AsPc-1细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养1 d，待细胞完全贴壁，分别加入100 μmol/L五味子甲素药液和等体积PBS，记为五味子甲素组和对照组。各组继续培养24 h，胰酶消化后取细胞置于流式管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，PBS洗涤细胞，按照凋亡检测试剂盒说明书分别加入Annexin V和PI试剂对细胞进行染色，4 ℃避光放置30 min，流式细胞仪检测。实验重复3次，取平均值。

1.5 不同浓度五味子甲素对AsPc-1细胞β-catenin蛋白和凋亡相关蛋白Bcl2、Bax表达的影响观察 采用Western blotting法。取AsPc-1细胞以5 000个/孔铺入到96孔板中，在37 ℃、5% CO2的培养箱中过夜，待细胞贴壁后，将AsPc-1细胞分为4组，分别加入25、50、100 μmol/L的五味子甲素药液和等量培养基，记为25 μmol/L组、50 μmol/L组、100 μmol/L组和对照组。将RIPA液、PMSF、磷酸化酶抑制剂及cocktail以100∶2∶2∶2比例混匀，配成细胞裂解液，分别加入到各组中，待各组细胞充分裂解后，收集到1.5 mL的EP管中，12 000 r/min离心15 min，取蛋白上清液，BCA定量后制备蛋白样品，以每孔30 μg进行上样，在聚丙烯酰胺凝胶中110 V恒压电泳120 min，湿转法转印到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭PVDF膜2 h，分别加入兔Bcl2、Bax、β-catenin多克隆抗体和鼠源性GAPDH内参抗体孵育，4 ℃过夜，TBST洗涤后加入山羊抗兔(鼠)二抗室温孵育2 h，TBST洗涤3次，滴加ECL超敏曝光液，在Biorad成像仪中暗室曝光，用Image pro plus软件分析条带灰度值，以目的条带灰度值与内参GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.6 五味子甲素对AsPc-1细胞β-catenin蛋白核定位的影响观察 采用免疫荧光法。AsPc-1细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养1 d，待细胞完全贴壁，分别加入100 μmol/L五味子甲素药液和等体积PBS，记为五味子甲素组和对照组。各组继续培养24 h，弃培养基，PBS洗涤，用多聚甲醛固定20 min，加入0.1%的曲拉通破膜处理15 min，PBS洗净残留曲拉通，加入含有5%BSA的PBS封闭30 min，加入β-catenin抗体，放置于湿盒中4 ℃过夜，常温复性30 min，PBS洗涤，避光条件下加入带CY3标记的荧光二抗，孵育2 h，PBS洗涤后用DAPI染色10 min，PBS洗弃残留DAPI，用抗荧光淬灭剂封片处理，荧光显微镜下拍照观察。

2 结果

2.1 不同浓度五味子甲素对AsPc-1细胞增殖的影响结果比较 ①12.5 μmol/L组、25 μmol/L组、50 μmol/L组、100 μmol/L组、对照组细胞增殖率分别为95.3%±3.5%、73.2%±1.8%、56.6%±3.3%、41.4%±2.9%、100.0%±0.0%，其中12.5 μmol/L组与对照组相比，P>0.05；其余各组间相比，P均<0.05；提示五味子甲素对AsPc-1细胞增殖有抑制作用，且抑制效果呈浓度依赖性。②五味子甲素组、对照组的细胞克隆数分别为(410±30)、(180±20)个，两组相比，P<0.05。

2.2 五味子甲素对AsPc-1细胞凋亡的影响结果比较 五味子甲素组、对照组的细胞凋亡率分别为16.36%±1.54%、4.58%±0.83%，两组相比，P<0.05。

2.3 不同浓度五味子甲素对AsPc-1细胞β-catenin蛋白和凋亡相关蛋白Bcl2、Bax表达的影响结果比较 随着五味子甲素浓度增加，Bcl2蛋白的相对表达量逐渐下调，而Bax蛋白的相对表达量逐渐增加，全长度β-catenin蛋白和78 kD的β-catenin蛋白的相对表达量也逐渐下调。见表1。

表1 各组细胞Bcl2、Bax、β-catenin蛋白相对表达量比较

注：与对照组相比，﹡P<0.05；与25 μmol/L组相比，﹟P<0.05；与50 μmol/L组相比，△P<0.05。

2.4 五味子甲素对AsPc-1细胞β-catenin蛋白核定位的影响结果比较 对照组β-catenin蛋白出现细胞核聚集现象，五味子甲素组β-catenin蛋白在细胞核的聚集明显减少。

3 讨论

胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，患者预后极差，尽管手术治疗、传统化疗药物化疗等不断完善，但是胰腺癌的5年生存率仍没有得到非常大的提高，同时由于化疗药物的大量使用，还存在着复发、耐药、化疗药物造成心肾毒性等方面的问题。因此，继续寻找有效的胰腺癌治疗药物有重要意义。

近年来，我国中药提取物在治疗肿瘤方面的潜在价值逐渐被重视。Nams 等[6]报道纳米磁粒包裹的白芦藜醇可以高效地被卵巢癌细胞SKOV3摄取且持续抑制其增殖能力；青藤碱可以通过抑制肿瘤细胞产生IL2、IL6、COX2等炎症因子，抑制胃癌、肝癌以及结直肠癌等多种肿瘤[7]；虫草素具有抑制骨肉瘤细胞增殖及诱导其凋亡的作用[8]。五味子是传统中草药之一，其提纯的五味子甲素是值得注意的有效成分之一。Lee等[3]发现，五味子甲素可引起卵巢癌细胞周期阻滞从而抑制卵巢癌细胞的增殖，还可以通过抑制肿瘤相关巨噬细胞的活性，减少微环境中的炎性因子。然而，五味子甲素是否对胰腺癌也有作用，目前还没有相关报道。在本研究中，我们发现五味子甲素可以抑制AsPc-1的细胞增殖和克隆形成，促进其凋亡，表明五味子甲素具有抑制胰腺癌细胞生长和促进其凋亡的潜在药用价值。

为了进一步探讨和验证五味子甲素对肿瘤细胞的调控作用，实验进一步检测了凋亡相关的标志性蛋白Bcl2和Bax。Bcl2是抑制凋亡的重要因子，位于线粒体外膜上，可通过降低线粒体的通透性，降低细胞色素C的释放，从而抑制细胞凋亡。Bax是促凋亡因子，一般位于细胞质中，当受到凋亡信号刺激时，会转位到线粒体外膜上，导致Bax二聚体的形成增多，线粒体膜的通透性增加，细胞色素C释放增多，细胞凋亡增加[9]。本研究发现，五味子甲素可以使AsPc-1细胞的Bcl2蛋白相对表达量下调，使Bax蛋白相对表达量上调，这种调控效应随五味子甲素浓度的增加而增强，表明五味子甲素可以通过调控Bcl2和Bax蛋白表达促进细胞凋亡。

在细胞中，调控Bcl2和Bax表达是一个复杂的网络体系[10,11]。β-catenin是其中重要的调控因素之一。为了解五味子甲素是否通过影响β-catenin及其78 kD水解片段的蛋白水平，从而参与调控Bcl2和Bax蛋白的表达，本研究对β-catenin蛋白及其水解片段进行检测，结果发现五味子甲素可以使AsPc-1细胞中的β-catenin蛋白及其78 kD水解片段的表达显著减少，而且78 kD水解片段减少更为显著。免疫荧光检测结果显示，五味子甲素组AsPc-1细胞中β-catenin蛋白在细胞核的聚集现象也明显减少。以上结果提示，五味子甲素可能通过影响β-catenin蛋白的表达和水解，减少其在细胞核内的定位，从而达到影响其转录因子活性的作用，进而抑制AsPc-1细胞的增殖，促进细胞凋亡。

综上所述，五味子甲素可以抑制人胰腺癌细胞AsPc-1的增殖(呈浓度依赖性)、克隆形成能力，促进细胞凋亡；五味子甲素可能是通过降低β-catenin蛋白的表达和水解、减少其在细胞核内的定位发挥调控作用。