2016～2017年北京地区非结核分枝杆菌菌种分布观察

张洁，王嫩寒，易俊莉，杨新宇，任怡宣，齐红伟，张宗德

(1 北京结核病控制研究所，北京100035；2 北京市红十字血液中心；3 首都医科大学附属北京胸科医院)

分枝杆菌属群中，除结核分枝杆菌复合群(包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)和麻风分枝杆菌外，其余分枝杆菌统称为非结核分枝杆菌(NTM)。NTM种类繁多，在自然界中广泛存在，但一些菌种会导致危及人类生命的疾病，死亡率很高[1]。研究[2]发现，免疫力低下的人更容易患NTM病，但患有慢性肺基础疾病的免疫力强的人也可感染NTM病。NTM病的发病率和流行率在全球范围内不断上升。NTM病临床表现、影像学特点与结核分枝杆菌病极为相似，但治疗方案却大不一样，因此，把分枝杆菌快速准确的鉴定至菌种水平是诊断和治疗各种分枝杆菌病的关键。采用生化试验鉴定分枝杆菌的技术是分枝杆菌菌种鉴定的经典方法，但由于其操作复杂、耗时长且结果不准确，现已不常使用。微阵列基因芯片技术将大量的核酸分子预先设计在固定的载体上，同时检测、分析大量的DNA或RNA，是一种大规模分析遗传差异的新方法，已广泛应用于分枝杆菌菌种的鉴定。本研究采用微阵列基因芯片法对2016～2017年北京地区分离出来的67株NTM菌株进行菌种鉴定，观察其菌种分布情况，从而为北京市NTM病临床诊断和治疗提供可靠的科学依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取北京结核病控制研究所2016～2017年分离出的NTM菌株67株，均经PCR-荧光探针法鉴定为NTM。67株NTM均分离自临床患者，同一患者的多份菌株标本按一份算。67例NTM分离患者中，男41例、女26例，男女比例为1.58∶1；15～30岁者13例，男13例、女0例；30～45岁者9例，男4例、女5例；45～60岁者7例，男2例、女5例；年龄>60岁者38例，男22例、女16例。

1.2 细菌、试剂与仪器 结核分枝杆菌标准菌株H37Rv由国家结核病参比实验室提供。晶芯分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(微阵列基因芯片法)、核酸提取仪ExtractorTM36、晶芯微阵列芯片扫描仪RLuxScanTM10K-B、晶芯芯片杂交仪BioMixerTMⅡ、晶芯SlideWasherTM8芯片洗干仪均购自博奥生物有限公司。Sigma 3K15低温高速离心机、PTC200 PCR扩增仪购自MJ公司。

1.3 菌种鉴定方法 在核酸提取管中加入50 μL核酸提取液，挑取单个菌落，放入核酸提取仪，最大转速振荡5 min后95 ℃水浴5 min，3 000×g离心2 min， -20 ℃保存。将2 μL提取出来的DNA加入至18 μL PCR反应体系中进行扩增，PCR扩增条件：37 ℃ 10 min；94 ℃ 10min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35 个循环；94 ℃ 30 s、72 ℃ 60s，10个循环；72 ℃延伸7 min。将PCR扩增产物放置于PCR扩增仪中95 ℃变性5 min，然后立即置于冰水混合物中冰浴3～5 min，从盖片的加样孔中加入14 μL杂交反应物，盖上杂交盒并密封，将密封好的杂交盒水平放入50 ℃的恒温水浴锅中120 min进行芯片杂交。每个微阵列只能加1份样品，记录芯片的编号、微阵列位置以及对应的样本编号。待杂交反应结束后，将芯片从杂交盒中取出，用十二烷基硫酸钠洗液和柠檬酸钠洗液冲洗干净，甩干后放入芯片扫描仪，用晶芯结核分枝杆菌耐药检测芯片判别系统判读芯片结果。检测NTM的微阵列芯片探针排布见图1。

12345 6789101表面化学质控探针杂交阳性外对照探针2空白对照探针内对照探针(分枝杆菌属)3结核分枝杆菌胞内分枝杆菌4鸟分枝杆菌戈登分枝杆菌5堪萨斯分枝杆菌偶然分枝杆菌6瘰疬分枝杆菌浅黄分枝杆菌7土分枝杆菌龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌8草分枝杆菌不产色分枝杆菌9海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌金色分枝杆菌10苏尔加分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌蟾蜍分枝杆菌11耻垢分枝杆菌阴性对照探针12杂交阳性外对照探针表面化学质控探针

图1 检测NTM的微阵列芯片探针排布示意图

2 结果

67株NTM菌株中经鉴定确定的菌种有11种，胞内分枝杆菌最多，占40.3%(27/67)，堪萨斯分枝杆菌占13.4%(9/67)，偶然分枝杆菌占11.9%(8/67)，鸟分枝杆菌占10.4%(7/67)，龟-脓肿分枝杆菌占7.5%(5/67)，耻垢分枝杆菌和戈登分枝杆菌各占3.0%(2/67)，草分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌各占1.5%(1/67)，不在检测范围内无法判读的菌株3株,占4.5%。部分NTM菌株微阵列输出图谱见图2。

3 讨论

研究[3]发现，在世界范围内NTM肺部疾病的发病率不断上升。NTM肺部疾病通常是慢性的，治疗过程漫长，即使在治疗成功后，再次感染的风险也很高。继往认为NTM不具有传染性，但近期文献[4]提示NTM可能具有传染性，且其诊断的困难性、高度耐药性和复发性都是导致其危害严重的原因。我国第五次结核病流行病学调查结果显示，NTM在分枝杆菌分离株中占22.9%(83/363)，调查数据比1990年(占4.9%)和2000年(占11.1%)全国流行病学调查结果明显升高。研究[5]发现，NTM感染率和流行情况有着明显的地区差异,且与气候环境相关，欧美等国家多以堪萨斯分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌为主要分离菌种,伊朗呼吸道标本中分离出来的最常见的NTM菌种为猿猴分枝杆菌。研究[6]结果显示，我国分离出来最多的NTM菌种为胞内分枝杆菌，在北方可达40%～60%，而南方地区除了胞内分枝杆菌外，脓肿分枝杆菌也占较高比例，与北方相比，南方NTM菌种更具有多样性。本研究鉴定出来的67株NTM中包含了11个菌种，数量前5位的菌种分别为胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、鸟分枝杆菌、龟-脓肿分枝杆菌，与相关研究结果一致。

本研究67例NTM分离患者中，NTM分离率男性高于女性,男女性别比例为1.58∶1,与报道[7]广州男性NTM感染率高一致。本研究67例NTM分离患者中，15～30岁男女比例差异较大(13∶0)，我们分析可能与该年龄段男性外出打工及外出求学比例较高有关。NTM是条件致病菌，其致病性远低于结核分枝杆菌，免疫力下降是NTM的主要易感因素。我们的研究结果也显示，60岁以上人群是NTM的分离主体，提示中老年人群可因免疫力下降而导致NTM感染率增高。

根据生化实验和鉴别培养基来进行分枝杆菌菌种鉴定的方法操作繁琐、效率低，鉴定快速生长型分枝杆菌需1～2周，鉴定缓慢生长型分枝杆菌需4～8周，鉴定结果还容易受多种条件的影响，可靠性差，而且不能完全将全部NTM菌种鉴定出来，已经难以满足临床需求。近年来，以PCR为基础的分子生物学方法鉴定分枝杆菌菌种已被国内外许多实验室采用，结果显示，分子生物学方法鉴定分枝杆菌更简便、快速，与传统方法可相互补充，对提高分枝杆菌的正确诊断率、指导临床合理用药有重要意义。本研究采用的微阵列基因芯片技术是DNA杂交技术和PCR不对称扩增技术相结合的分子诊断方法，具有很好的特异性和敏感性，快速、操作简单,能同时检测临床上常见分枝杆菌的17个菌种，可以在2个工作日内得到检测结果，且芯片上设有多种质控探针，具有很好的质量控制，保证了结果的准确性[8]。微阵列基因芯片法检测的对象是DNA片段，无须接触活菌，生物安全性较高，另外，通过软件自动判读结果，操作简便，自动化程度高，可减少人为误差，便于临床实验室检测。通过2年的数据积累，我们也看到，本研究67株NTM中还有3株病菌不在检测范围内，无法鉴定到种属，说明微阵列基因芯片技术还存在一定的局限性，对于不常见的分枝杆菌的检测还有待开发；对于种内序列差异较大的分枝杆菌，应增加分子标识的检测数量以提高分辨率和检出率；单一的DNA同源序列分辨力不足，一些亲缘关系相近的分枝杆菌无法被准确鉴别，如无法准确区分具有临床诊断价值的龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌。

综上所述，2016～2017年北京地区NTM菌种分布达11个种，以胞内分枝杆菌最多。随着结核分枝杆菌病的逐步可控，NTM病的临床诊断及治疗已经成为越来越突出的问题，分子生物学诊断技术的发展和成熟为NTM的快速、高效检测提供了一个新的发展契机，需要实验室人员及临床医务人员的不断关注。