基于果实和果肉细胞特征的辣椒资源相关性和聚类分析

杨 涛，唐亚萍，帕提古丽，张国儒，王柏柯，李 宁，余庆辉，杨生保

(新疆农业科学院园艺作物研究所，乌鲁木齐830091)

0 引言

【研究意义】辣椒属于茄科(Solanaceae)茄亚族(Solaninae Dunal)辣椒属(Capsicum)，一年生或多年生，起源于中南美洲热带地区的墨西哥、秘鲁等地[1]。辣椒为二倍体，自花授粉，与马铃薯、茄子、番茄、烟草和矮牵牛是近亲，已完成了基因组测序[2-3]。辣椒含有类胡萝卜素、黄酮苷和维生素等，辣椒籽中也含有多种膳食纤维、蛋白质、脂肪、氨基酸和不饱和脂肪酸等，其中最独特的莫过于辣椒中辣椒碱类复合物，其产生于果实的胎座腺体，由于辣椒碱类物质的积累，使人产生辛辣感和灼热感[4-6]。目前全世界辣椒种植面积达370×104hm2，是第3大类蔬菜作物，我国种植面积在133 hm2左右，仅次于大白菜，且全国已初步形成六大辣椒主产区[4,7-9]。研究不同辣椒资源各调查性状间的相关性和聚类分析,为建立新疆制干辣椒品种选育改良奠定一定的基础。【前人研究进展】辣椒栽培种划分为5个种，在我国栽培的辣椒至少有3个种—C.annuumL.、C.frutescensL.和C.ChinenseJacq.，未来遗传育种的竞争首先是资源，种质资源的表型性状鉴定和优异资源的深入挖掘，对品种选育和产业的发展意义重大[10,11]。在辣椒种质资源的表型鉴定研究方面，前人通过不同的研究对象和分析方法进行了较广泛的研究，对贵州地区辣椒资源的品质性状进行了深入分析，对湖南地区辣椒地方品种资源主要农艺性状进行了研究分析，对收集而来的辣椒种质资源的主要农艺性状进行了系统研究[11-16]。同时，利用不同的生物技术手段，均对不同的辣椒资源群体进行了大量的分类研究[17-23]。研究表明，辣椒红色素色价和辣椒红素含量相关性很好[29]。辣椒红素是辣椒红色素显色的主要成分、物质基础，因此,是国内外广泛采用的色价评价法。色价能够一定程度上反映辣椒红素含量。【本研究切入点】新疆由于独特的地理气候条件，特别适宜制干型辣椒产业的发展，是我国重要的制干辣椒产区，年种植面积已达3.5×104hm2[24-25]。在新疆，每年9至10月大批新鲜的辣椒被机械或人工采收后进行天然晾晒，辣椒果实在经历一系列的生理生化反应后开始脱水直至被晾干，生产中一般要求辣椒干的含水量控制在15%～18%。脱水过程中，水分从果实中损失到外部的环境中一般取决于三个结构障碍，分别为细胞壁、细胞膜和外表皮，外表皮位于上皮细胞的顶层，包裹着整个果实，是限制水分从果实散失到环境中的最后一层屏障，果实水分的损失与果实表皮的蜡质含量呈极显著相关[26-27]。虽然前人已针对不同地区适宜的不同类型的辣椒种质资源进行了研究[11-16]，但特异针对适宜新疆气候区域的种质鉴定筛选研究报道不多。研究基于果实和果肉细胞特色的辣椒资源相关性和聚类分析。【拟解决的关键问题】以24份经分离纯化的辣椒种质资源为研究对象，调查参试材料的果实主要性状，利用Image J软件测定了辣椒果实横切面果实面积和果腔面积，利用石蜡切片技术完成了所有参试材料的果肉细胞调查，在自然室温条件下调查不同参试材料果实75%水分损失的耗时，分析不同辣椒资源各调查性状间的相关性和聚类分群，为适宜新疆制干辣椒品种选育的进一步改良奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

材料分别为制干辣椒果实GB-6、GB-8、GB-9、GB-11、GB-14、GB-18、GB-20、GB-25、GB-26、GB-29、GB-35、GB-36、GB-38、GB-41、GB-42、GB-43、GB-44、GB-45、GB-48、GB-50、GB-51、GB-55、GB-56、GB-57，均为高代自交纯合体。种子由新疆农业科学院园艺作物研究所繁殖。表 1

表 1 供试材料及来源
Table 1 List of materials

编号Code品系名称Name of lines来源Origin果形Fruit shape编号Code品系名称Name of lines来源Origin果形Fruit shape1GB-6焉耆短羊角形13GB-38博湖短羊角形2GB-8广州长羊角形14GB-41焉耆长羊角形3GB-9焉耆短羊角形15GB-42广州线形4GB-11贵州短羊角形16GB-43贵州线形5GB-14湖南长指形17GB-44和硕线形6GB-18四川短羊角形18GB-45湖南线形7GB-20和硕短羊角形19GB-48广州长羊角形8GB-25山西短羊角形20GB-50北京长灯笼形9GB-26湖南线形21GB-51山西长羊角形10GB-29博湖短羊角形22GB-55和硕短羊角形11GB-35山西短羊角形23GB-56贵州短羊角形12GB-36焉耆短羊角形24GB-57贵州长羊角形

1.2 方 法

1.2.1 田间试验

田间试验于2017年3月20日至9月20日在新疆农业科学院安宁渠良种繁育场进行。田间试验均采用随机区组试验设计，3次重复，双行种植，行距30 cm，株距25 cm，沟心距1.5 m，每小区种植20株，采用膜下滴灌栽培模式，田间管理同大田。3月20日播种，5月10日定植。根据每小区种植株数，在果实开始成熟时每天调查各研究材料的成熟株数，当小区成熟株数达到总株数的50%时，记为该小区该材料的始熟期，并于始熟期后15 d于每小区随机采摘10个成熟的单果进行各果实性状的调查，每份研究材料再混合采摘3个果实用于石蜡切片和扫描电镜观察。

1.2.2 果实表型性状

用游标卡尺进行果肉厚、果实纵径、果实横径、果梗宽和果梗长的测定，用电子秤进行单果重的测定。当每个品系的果实完全达到红熟期时，于各小区随机采摘10个果实，于每个果实靠近果洼近1/3处进行横切，后在果实旁边放置标尺，并用佳能EOS 60D相机拍照，用Image J软件进行果实横切腔室面积和总果实面积的统计，腔室面积占比为腔室面积与果实面积的比值。参照国家标准GB10783-2008进行辣椒色价的测定。

1.2.3 果肉组织的石蜡切片

将材料新鲜果肉纵切取大小为1 cm×1 cm×0.5 cm的果肉组织，立即用福尔马林醋酸酒精(formalin acetic acid alcohol, FAA)混合固定液(70%乙醇90 mL+38%福尔马林5 mL+99.5%冰乙酸5 mL)固定，采用石蜡切片制片，将固定好的样品冲洗后，按照70%、80%、85%、90%、95%、100%、100%的乙醇浓度对样品逐级脱水，再用1∶1的无水乙醇和二甲苯，二甲苯，二甲苯逐级透明，然后连续3 d浸蜡，每天换蜡两次，之后切片染色(番红固绿对染)，最后用中性树胶封片，切片厚度为10 m，番红固绿双重染色，用中性树胶封片。采用Olympus自动显微装置观察摄影，并利用Image J软件对同一视野下不同研究材料的外果皮厚度、细胞面积、细胞周长、细胞纵径、细胞横径进行统计观测。利用Image J软件对不同研究材料的果肉细胞和外果皮厚度性状进行统计观测[28]。

1.2.4 损耗75%的水分所需天数

在辣椒果实大量达到完全红熟后，每小区随机采摘10个完好无损的果实，用清水清理干净果面后，迅速用吸水纸擦拭果面，将其放置在消毒过的实验台面上，置于室温下，用电子天平每隔1 d称取10个果实的重量，直至达到75%的水分损失止，统计每份研究材料损耗75%的水分所需的天数。

1.3 数据处理

用Excel进行数据的录入整理，用用SPSS 19.0进行相关性与聚类分析。

2 结果与分析

2.1 主要果实性状差异

表2 各调查性状变异
Table 2 Variations of traits

性状Traits最小值Min.最大值Max.均值Mean标准误SE变异系数CV(%)果肉厚Pericarp Thickness(cm)0.120.280.210.0524.81果实纵径Fruit Longitudinal Diameter(cm)8.9520.1213.803.3436.26果实横径Fruit Transverse Diameter(cm)1.385.452.580.9324.17果梗宽With for Fruit Stalk(cm)0.771.471.110.2119.25单果重 Fruit Weight(g)8.2781.9127.3019.6972.14果梗长Length for Fruit Stalk(cm)2.567.264.431.1225.22果实面积Total Fruit Area(cm2)1.1814.774.312.8265.28腔室面积Fruit Cavity Area(cm2)0.6810.712.852.0872.92腔室面积占比Proportion for Cavity Area and Total Fruit Area(%)54.0776.6363.816.4510.11

研究表明，24份材料的果肉厚在0.13 cm～0.28 cm浮动，平均为0.21 cm，GB-36的果肉最薄为0.13 cm，GB-41、GB-42的果肉最厚为0.28 cm。24份材料的平均果实纵径为13.80 cm，其中，GB-43的果实纵径值最大为20.12 cm，GB-29的果实纵径最小为8.95 cm。GB-50的果实横径值最大为5.45 cm，GB-44的果实横径值最小为1.38 cm，24份材料的平均果实横径为2.58 cm。GB-41的近果洼处果梗最宽为1.47 cm，GB-44和GB-56的近果洼果梗最窄为0.77 cm，24份材料的平均近果洼处果梗为1.11 cm。在单果重方面，GB-50的单果重最大为81.91 g，GB-56的单果重最小为8.27 g，24份材料的平均单果重为27.30 g。GB-42的果梗最长为7.26 cm，GB-48的果梗最短为2.56 cm，24份材料的平均果梗长为4.43 cm。GB-48的果实面积和腔室面积都最大，分别为14.77 cm2、10.71 cm2，GB-44的果实面积最小为1.18 cm2，GB-56的腔室面积最小为0.68 cm2，24份材料的平均果实面积腔室面积分别为4.31和2.85 cm2。在腔室面积占比方面，GB-36的腔室面积占比最大为76.63%，GB-42的腔室面积占比最小为54.07%，24份材料的平均腔室面积占比为63.81%。表2

注：a～x分别为GB-6、GB-8、GB-9、GB-11、GB-14、GB-18、GB-20、GB-25、GB-26、GB-29、GB-35、GB-36、GB-38、GB-41、GB-42、GB-43、GB-44、GB-45、GB-48、GB-50、GB-51、GB-55、GB-56和GB-57果肉组织石蜡切片在20 m视野下的照片

Note: a-x refer to pericarp tissue of parafin section of GB-6, GB-8, GB-9, GB-11, GB-14, GB-18, GB-20, GB-25, GB-26, GB-29, GB-35, GB-36, GB-38, GB-41, GB-42, GB-43, GB-44, GB-45, GB-48, GB-50, GB-51, GB-55, GB-56 and GB-57 at 20 μm vision, respectively

图1 果肉组织石蜡切片
Fig.1 Photos of pericarp tissue for paraffin section

2.2 果肉组织细胞结构差异

研究表明，20 μm视野下24份材料的平均果肉细胞面积为2 068.97 μm2，其中，平均果肉细胞面积最大的为GB-57为3 287.08 μm2，平均果肉细胞面积最小的为GB-45为1 265.48 μm2。24份材料的果肉细胞周长平均为157.56 m，其中，果肉细胞周长最大的为GB-57为197.44 μm，果肉细胞周长最小的为GB-29为133.69 μm。24份材料的果肉细胞纵径平均为62.06 μm，其中，果肉细胞纵径最大的为GB-51为76.95 μm，果肉细胞纵径最小的为GB-45为52.12 μm。24份材料的果肉细胞横径平均为29.74 μm，其中，果肉细胞横径最大的为GB-57为38.69 μm，果肉细胞横径最小的为GB-20为23.63 μm。24份材料的平均外果皮厚度为16.39 μm，外果皮厚度最大的为GB-44为20.06 μm，外果皮厚度最小的为GB-48为10.17 μm。表2,图1

表3 不同类型辣椒果肉细胞形态差异
Table 3 Variance of pericarp cell shape of different genotype pepper

材料Lines细胞面积Cell area (μm2)细胞周长Cell perimeter (μm)细胞纵径Cell longitudinal diameter (μm)细胞横径Cell transverse diameter (μm)外果皮厚度The thickness of the outer pericarp(μm)GB-62 582.69±804.39168.76±23.0767.19±10.3329.99±3.8315.93±1.91GB-81 627.72±418.68148.90±22.6161.83±9.1924.89±3.7918.81±0.93GB-92 183.81±655.32160.31±20.6061.89±7.7230.22±6.4119.59±2.19GB-111 883.56±358.62153.47±13.8459.28±5.5328.69±3.6316.81±1.25GB-142 367.21±416.31161.34±14.2364.64±6.1226.99±2.2817.99±1.41GB-182 141.05±618.53157.94±22.2061.71±8.9629.74±5.9618.65±2.03GB-201 313.86±247.79134.43±12.4454.44±4.9423.63±2.9116.72±0.95GB-252 117.85±846.38161.47±22.5162.57±7.1230.19±7.5811.68±3.93GB-262 049.84±866.81146.85±24.4257.39±9.9530.95±5.8316.14±1.14GB-291 478.57±481.30133.69±16.6853.50±6.7028.21±4.6416.70±1.36GB-352 114.53±761.49158.99±27.9864.51±11.3430.60±6.1619.23±1.56GB-362 095.54±550.07161.55±22.3664.15±8.8930.15±3.6219.45±1.95GB-382 612.78±715.10166.35±19.2967.90±8.3934.07±6.4218.83±2.23GB-412 052.96±326.30156.34±15.1562.44±5.2830.76±3.6512.91±2.56GB-421 526.80±617.97141.43±22.4255.25±8.9025.51±5.8913.64±1.40GB-432 394.87±912.41168.11±22.7467.49±8.9431.51±6.9015.29±1.13GB-441 530.57±283.75136.43±15.2053.89±6.9126.04±1.9920.06±1.90GB-451 265.48±363.69136.04±20.4452.12±8.2823.64±4.1519.11±2.24GB-482 348.16±337.95174.54±15.6566.98±7.3133.69±3.6710.17±1.32GB-502 210.49±661.07173.98±23.2967.28±9.2533.74±5.6214.84±1.85GB-512 850.56±914.22193.95±28.9576.95±11.5631.54±7.1014.73±3.03GB-551 843.88±712.52146.27±24.9055.26±9.1429.53±7.0615.73±2.01GB-561 775.44±183.73142.97±8.9954.77±4.3630.85±2.0719.04±3.10GB-573 287.08±1001.33197.44±30.2976.05±11.8238.69±6.9011.36±1.83

2.3 色价及其沥干耗时差异

研究表明，24份研究材料的色价在6～25浮动，平均色价为15.68，其中，GB-14的色价最高为25，GB-11的色价最低为6。24份辣椒资源的室温下平均沥干耗时为23 d，其中，耗时最短的为GB-36号，仅需12 d，GB-55号和GB-57号耗时最长，需37 d。图2

注：a和b分别为各品系的色价值，各品系损失75%的水分需要的耗时

Note: a and b refer to the color value of each lines and the time-consuming of the fruit losing 75% water, respectively

图2 各研究材料色价和损失75%的水分需要耗时
Fig.2 The color value of each lines and the time-consuming of the fruit losing 75% water

表4 各调查性状间相关性系数
Table 4 Correlation coefficient between each traits

注：“*”和“**”分别表示显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)相关。果肉厚：PT；果实纵径：FL；果实横径：FT；果梗粗：WS；单果重：FW；果梗长：LS；果实面积：FA；腔室面积：CA；腔室面积占比：PAFI；细胞面积：AC；细胞周长：LC；细胞纵径：FC；细胞横径：HC；外果皮厚度：TCP；色价：CV；沥干时间：TFL

Note: “ * ” and “ ** ” represent significantly difference at 0.05 and 0.01 level, respectively.Pericarp Thickness, PT; Fruit Longitudinal Diameter, FL; Fruit Transverse Diameter, FT; With for Fruit Stalk, WS; Fruit Weight, FW; Length for Fruit Stalk, LS; Total Fruit Area, FA; Fruit Cavity Area, FCA; Proportion for Cavity Area and Total Fruit Area, PCT; Cell Area, CA; Cell Perimeter, CP; Cell Longitudinal Diameter, CLD; Cell Transverse Diameter, CTD; The Thickness of The Outer Pericarp, TOP; The Color Value, CV; The Time-consuming of The Fruit Losing 75% Water, TFL

2.4 各调查性状间相关性

研究表明，各调查性状间存在不同程度的显著或极显著正负相关，相关系数介于-0.625**～0.976**。其中，果肉厚与7个性状存在显著或极显著的正负相关，相关系数介于-0.625**～0.679**；果实纵径FL不与任何性状存在相关性；果实横径与7个性状存在显著或极显著的正相关，相关系数介于0.448*～0.904**；果梗粗与果肉厚和果梗长存在显著和极显著正相关，相关系数分别为0.663**和0.405*；单果重与7个性状存在限制或极显著正负相关，相关系数介于-0.500*～0.904**；果梗长分别与果肉细胞面积和单果重存在显著正负相关，相关系数分别为-0.442*和0.405*；果实面积、腔室面积和腔室面积占比均与5个性状存在显著或极显著正负相关，相关系数介于-0.048 1*～0.992**；果肉细胞面积与3个性状存在极显著正相关，相关系数介于0.840**～0.944**；果肉细胞周长与6个性状存在显著或极显著正负相关，相关系数介于-0.471*～0.976**；细胞纵径和细胞横径分别与5个和4个性状存在显著或极显著正负相关，相关系数介于-0.457*～0.976**；外果皮厚度与4个性状存在显著或极显著负相关，相关系数介于-0.625*～-0.457**；色价CV仅与果肉厚存在显著的负相关，相关系数为-0.413*；沥干时间仅与腔室面积占比存在显著负相关，相关系数为-0.481*。表4

2.5 基于调查性状聚类

通过参试材料各调查性状的系统聚类分析，在距离比例为9时，类间距离比较大，24份材料可分为五大类，各类的特点比较突出，其中第Ⅰ大类包含8份材料，分别为GB-6、GB-11、GB-18、GB-25、GB-26、GB-41、GB-42、GB-55。第Ⅱ大类6份，分别为GB-20、GB-29、GB-43、GB-44、GB-45、GB-56。第Ⅲ大类包含3份，分别为GB-48、GB-50、GB-51；第Ⅳ大类均仅包含6份材料，分别为GB-8、GB-9、GB-14、GB-35、GB-36、GB-38；第Ⅴ大类仅包含1份材料，为GB-57。图3

图3 辣椒资源各测试性状的聚类
Fig.3 The cluster analysis of the pepper resources’s each characteristic

3 讨 论

3.1 参试材料评价

新疆是我国重要的制干辣椒产区，适宜制干类型的种质资源表型性状鉴定和优异资源挖掘显的尤为重要[10,24]。生产中，为了能在早期获得较大的价格收益，种植户往往对易晾干、色价高的品种情有独钟。研究发现，参试材料中，在20 d内可完成75%的水分损失，同时色价在20以上的材料共计有3份，分别为GB-14、GB-36和GB-45，其损耗75%的水分所需的时间分别为18、12和13 d，单果重分别为25.84、16.52和11.96 g，其色价分别为25、22和21。有研究发现，高水分损失率辣椒整体上较低水分损失率辣椒成熟的要早[30]。

3.2 各性状间相关性

外表皮覆盖在所有陆生植物器官的最外层，是一种蜡质表层，在防止水分损失、病菌侵染、品质、硬度和光泽的修饰方面扮演重要的角色[31-32]。与大多数果实相比，辣椒果实对采后水分损失伤害极其敏感，这与辣椒是一种中空的果实有关，这一点限制了其长期大量贮存水分的能力[30]。研究发现，辣椒果实的沥干耗时仅与果实腔室面积占比存在显著负相关，相关系数为-0.481*，与其它调查性状间的相关性较低。辣椒果实的水分损失性状是个比较复杂的性状，有研究发现，辣椒果实的水分损失率与内部的含水量、果实的面积体积比呈正相关，与果实的面积呈负相关[30]。也有研究指出果实外果皮的透水性并不与外果皮的厚度和总蜡质含量相关，比如在果实贮藏过程中，重量损失与外表皮的结构并没有任何关系[30]。研究发现，辣椒果实采后水分损失(PWL)由两个位于10号染色体上的QTL调控，分别为PWL10.1和PWL10.2[30]。

辣椒果实中的主要色素是辣椒红素和辣椒玉红，通过辣椒红素-辣椒玉红合酶(CCS)由辣椒特有的类胡萝卜素路径合成[33]。而成熟辣椒果实的颜色主要依赖于辣椒红素和辣椒玉红的积累差异，且都参与类胡萝卜素合成路径[34]。成熟过程中，红色辣椒积累了较高水平的类胡萝卜素[35]。因此，类胡萝卜素复合物决定了成熟辣椒果实的颜色[36]。也正因为类胡萝卜素复合物的差异变化，不同辣椒品种成熟时呈现多样(白色到深红色)的果实颜色[35]。据研究，辣椒Ccs基因启动子区的重复单元中，存在光、温敏感元件，解释了为何的阳光和高温促进辣椒红素和辣椒玉红的积累[35]，而这也从一个侧面解释了新疆优越的光照资源条件，有利于红色素含量的提高。通过相关性分析，研究发现色价CV仅与果肉厚存在显著的负相关，相关系数为-0.413*，同时，还发现所有参试材料的平均色价为15，低于色价15的材料合计有9份，最低的为GB-11，色价为6，据观察，该份材料晾干后易发生花皮现象。成熟辣椒果实的颜色遗传机制较为复杂，尚未全面解析[34]。在辣椒(Capsicumannuum)果实未成熟和成熟发育过程中，其基因型表现了大范围的颜色和色彩强度差异[37]。

3.3 聚类分析

聚类的方法有多种，最常用的是系统聚类，聚类的基本原则是将相近的聚为一类，即聚类最近或最相似的聚为一类[38]。将36个湖南辣椒地方品种分为五大类[38]。根据辣椒资源的品质性状，将93份贵州地方辣椒资源分为四大类，各类群品质特点差异明显[15]。通过39个表型性状调查数据，将国外引进的30份辣椒资源分为三大类[39]。将全国收集的205份辣椒资源分为七类[16]。将331份辣椒资源分为两大类[11]。通过参试材料各调查性状的系统聚类分析，研究将24份材料分为五大类，各类的特点比较突出，其中第Ⅴ大类仅包含1份材料，该材料的独特性。

4 结 论

4.1 24份辣椒高代自交系试验材料，在20 d内可完成75%的水分损失，同时色价在20以上的材料共计有3份，分别为GB-14、GB-36和GB-45，其损耗75%的水分所需的时间分别为18、12和13 d，单果重分别为25.84、16.52和11.96 g，其色价分别为25、22和21。

4.2 各调查性状间存在不同程度的显著或极显著正负相关，相关系数介于-0.625**～0.976**；色价仅与果肉厚存在显著的负相关，相关系数为-0.413*；果实的沥干耗时仅与果实腔室面积占比存在显著负相关，相关系数为-0.481。

4.3 通过参试材料各调查性状的系统聚类分析，将24份材料分为五大类，各类的特点比较突出，其中第Ⅴ大类仅包含1份材料，GB-57该材料具有独特性。