转扁桃AcCBF1基因对烟草光合及叶绿素荧光特性的影响

张 琦，李 鹏，田 嘉，李 疆

(新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】扁桃(AmygdaluscommunisL.)是四大干果树种之一，种仁营养价值丰富，加工产品多种多样[1-3]。我国栽培扁桃主要分布在新疆喀什地区莎车县、英吉沙县及其周边地区[4]，目前栽培扁桃面积约7.5×104hm2，年产量约6×104t我国新疆自产扁桃远不能满足国内市场需求[5]，据统计我国2017年进口带壳扁桃约7×104t，进口扁桃约9×104t[6]。我国扁桃平均单株产量较低(约5 kg)，仅是美国加州扁桃平均单株产量的1/5～1/3，这与我国新疆地区冬季较严寒、春季多霜冻、夏季炎热干旱有很大的关系，选育抗逆性较强，产量稳定的扁桃新品种迫在眉睫。【前人研究进展】植物CBF及其家族基因参与调控植物抗寒、抗旱、抗盐碱等多种生理过程[7-8]，在光合作用[9]、水分运输[10]、激素(IAA、GA、SA、BR)代谢及信号转导[11]中发挥重要调控作用。扁桃中研究发现CBF基因在逆境中起作用，如AlsCBF[12]、SG-AcCBF1[13]、AcCBF2[14]均受干旱、低温等非生物胁迫诱导表达。【本研究切入点】光合作用为植物的生长发育提供源源不断的碳水化合物，与植物生长息息相关[15]。叶绿素荧光动力学反应技术可检测光合作用“内在性”指标[16]，通过分析叶绿素荧光参数变化，有助于快速了解PSⅡ系统对光吸收、传递、耗散和分配等过程，直接或间接反映植物光合能力和抗逆能力[17,18]。目前国内外对CBF及其家族基因的研究多集中在低温胁迫、盐碱胁迫等，对CBF基因在光合作用中的研究较少。研究转扁桃AcCBF1基因烟草光合及叶绿素荧光特性。【拟解决关键问题】试验通过农杆菌介导法获得转扁桃AcCBF1基因烟草，在经过连续室外37℃高温天气一周后，以野生烟草为对照，对其光合特性及叶绿素荧光参数进行测定分析，分析扁桃AcCBF1基因对光合作用的影响，为选育抗逆性较强、产量稳定的扁桃新品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

塞姆氏烟草(NicotianatabacumL.)，pCAMBIA1304-AcCBF1甘油菌及质粒均由实验室保存。DNA聚合酶、质粒提取试剂盒购于北京全式金公司；头孢噻肟钠(Cefotaxime sodium，Cef)、卡那霉素(Kanamycin，Kan)、利福平(Rifampicin，Rif)、DNA Maker D 2000均购自上海生工生物工程有限公司；乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)购自Biosharp生物科技公司；引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 转扁桃AcCBF1基因烟草植株获得

1.2.1.1 农杆菌介导法

参照晁朝霞[19]的方法进行异源转化烟草。表1

表1AcCBF1、Hyg、GUS片段扩增引物序列
Table 1 Primer sequence amplified byAcCBF1,Hyg,GUSfragment

名称Name序列OrderGUS-F5’-AGACTATCCCGCCGGGAATGG-3’GUS-R5’-GCGGTGATACATATCCAGCCA-3’AcCBF1-F5’-CGGAATTCATGAACAGGTTCTTCTCTCATTT-3’AcCBF1-R5’-CGGGATCCTTAATTGGAGAAACTCCACAATT-3’Hyg-F5’-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3’Hyg-R5’-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG-3’

1.2.1.2 转基因烟草鉴定

采用CTAB法[20]提取烟草DNA。转AcCBF1基因植株采用三对引物(AcCBF1基因引物、GUS基因引物、Hyg引物)进行PCR检测，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 光合特性

参照韩拓[21]、牛莹莹[22]等方法。在经过连续室外37℃高温天气一周后，于2018年8月16日，晴天无云，从08：00～20：00，每2 h使用GFS-3000便携式光合作用测定仪(德国WALZ公司)测定成熟功能叶的净光合速率Pn、气孔导度Gs、蒸腾速率Tr、胞间CO2浓度Ci。分别选取3株长势一致且无病虫害的转基因烟草和野生烟草，每株取3片叶子进行标记和测定，每个叶片测定3次。

1.2.3 叶绿素荧光参数

参照牛莹莹[22]、刘卫群[23]等方法。使用FMS-2便携脉冲调制式荧光仪(英国Hansatech公司)进行测定已标记叶片的初始荧光Fo、最大荧光Fm等参数，并计算可变荧光Fv(Fv = Fm-Fo)最大光能效率Fv/Fm、PSII潜在活性Fv/Fo、PSII实际光化学效率ΦPSII。

1.3 数据处理

利用Excel 2003和SPSS 19.0软件进行数据整理和分析，Excel 2003进行绘图。

2 结果与分析

2.1 农杆菌介导法转AcCBF1基因烟草

2.1.1 菌液PCR

采用冻融法将pCAMBIA1304-AcCBF1甘油菌进行培养，挑取单菌落进行活化后进行菌液PCR检测，1%凝胶电泳，3条目的基因条带(GUS基因目的条带为1 081 bp，Hyg基因目的条带为556 bp，AcCBF1基因目的条带为750 bp左右)明亮清晰，侵染所用菌液准确可靠。图1

M：DL2000 Marker；1：GUS基因引物PCR产物；2：AcCBF1基因引物PCR产物；3：Hyg基因引物PCR产物

M: DL2000 Marker; 1:GUSgene primer PCR product; 2:AcCBF1 gene primer PCR product; 3:Hyggene primer PCR product

图1 菌液PCR鉴定
Fig.1 PCR identification of bacteria liquid

2.1.2 转AcCBF1基因烟草的获得

烟草叶盘经过预培养、共培养后转移至筛选培养基上培养约20 d左右，叶盘边缘出现愈伤组织，继续培养至分化出抗性芽，待抗性芽长至2～3 cm时转移至生根培养基中，30 d左右根系发育健全；待抗性苗长至3～4片叶时，揭开盖子2～3 d进行炼苗，洗去培养基，将抗性苗移栽至装有无菌土的花盆中进行培育。图2

A：预培养叶盘；B：共生叶盘；C：抗性芽；D：再生植株生根

A: Pre-cultured leaves ; B: Col-cultured leaves; C: Regenerate buds; D: The root of regenerated plant.

图2 烟草抗性芽的筛选及再生植株获得
Fig.2 Selection of tobacco resistant buds and regenerated tobacco plants

2.1.3 转AcCBF1基因烟草的鉴定

采用改良后的CTAB法提取烟草DNA，通过AcCBF1基因、GUS基因、Hyg基因3对引物进行PCR鉴定，3对引物同时扩增出目标条带的抗性植株为转AcCBF1植株，经筛选获得三株转AcCBF1烟草植株。图3

M：DL2000 Marker；1～5：GUS基因引物PCR产物；1～3：转基因烟草植株；4：野生烟草植株；5：pCAMBIA1304-AcCBF1质粒；6～10：AcCBF1基因引物PCR产物；6～8：转基因烟草植株；9：野生烟草植株；10：11～15：Hyg基因引物PCR产物；11～13：转基因烟草植株；14：野生烟草植株；15：pCAMBIA1304-AcCBF1质粒

M: DL2000 Marker; 1-5:GUSprimer PCR products; 1-3: transgenic tobacco plants; 4: wild tobacco plants; 5: pCAMBIA1304-AcCBF1 plasmid; 6-10:AcCBF1 gene primer PCR products; 6-8: transgenic tobacco plants; 9: wild tobacco plants; 10: pCAMBIA1304-AcCBF1 plasmid; 11-15:Hygprimer PCR products; 11-13: transgenic tobacco plants; 14: wild tobacco plants; 15: pCAMBIA1304-AcCBF1 plasmids

图3 转AcCBF1烟草植株鉴定
Fig.3 Plant Identification of transgenic Tobacco withAcCBF1

2.2 光合参数日变化规律

2.2.1 净光合速率(Pn)日变化

两种烟草的Pn日变化趋势一致，均呈现“双峰”曲线，且两次峰值出现时间一致。Pn在12:00达到第一个峰值，转基因烟草和野生烟草的Pn值分别为11.434 、8.714 μ mol/(m2·s)；16:00出现光合“午休”，二者Pn值分别为3.014 、2.529 μmol/(m2·s)；18:00达到第二个峰值，二者Pn值分别为4.295、3.779 μmol/(m2·s)。转基因烟草和野生烟草的Pn日均值分别为6.496 、4.553 μmol/(m2·s)。图4

图4 净光合速率日变化
Fig.4 Diurnal variation of net photosynthetic rate

2.2.2 气孔导度(Gs)日变化

两种烟草的Gs日变化趋势一致，均呈现“双峰”曲线，且两次峰值出现时间一致。Gs在12:00达到第一个峰值，转基因烟草和野生烟草的Gs值分别为223.695 、197.693 μmol/(m2·s)；16:00出现光合“午休”，二者Gs值分别为143.348 、124.411 μmol/(m2·s)；18:00达到第二个峰值，二者Gs值分别为151.377、141.973 μmol/(m2·s)。转基因烟草和野生烟草的Gs日均值分别为157.357 、133.371 μmol/(m2·s)。图5

图5 气孔导度日变化
Fig.5 Diurnal variation of stomatal conductance

2.2.3 蒸腾速率(Tr)日变化

两种烟草的Tr日变化趋势一致，均呈现“双峰”曲线，且两次峰值出现时间一致。Tr在14:00达到第一个峰值，转基因烟草和野生烟草的Tr值分别为3.655 μmol/(m2·s)、4.618 μmol/(m2·s)；16:00出现光合“午休”，二者Tr值分别为2.083μmol/(m2·s)、2.328 μmol/(m2·s)；18:00达到第二个峰值，二者Tr值分别为2.851 μmol/(m2·s)、3.078 μmol/(m2·s)。转基因烟草和野生烟草的Tr日均值分别为2.198 μmol/(m2·s)、2.670 μmol/(m2·s)。图6

图6 蒸腾速率日变化
Fig.6 Diurnal variation of transpiration rate

2.2.4 胞间CO2浓度(Ci)日变化

两种烟草的Ci日变化与Pn、Gs刚好相反。Ci在12:00达到第一个谷值，转基因烟草和野生烟草的Ci值分别为167.173 、193.159 μ mol/mol；16:00出现光和“午休”，二者Ci值分别为228.369 、245.689 μmol/mol；18:00达到第二个谷值，二者Ci值分别为198.086、209.022 μmol/mol。转基因烟草和野生烟草的Ci日均值分别为231.879 、253.096 μmol/mol。图7

图7 胞间CO2浓度日变化
Fig.7 Diurnal variation of intercellular CO2concentration

2.3 叶绿素荧光参数日变化规律

2.3.1 Fo和Fm的日变化

转基因烟草和野生烟草的Fo均呈现出先上升后下降的日变化趋势，在16:00时升至最高。两种烟草的峰值分别为177.667、246.667，日均值分别为144.333、176.333，转基因烟草的Fo低于野生烟草。Fm呈现先下降后上升的日变化趋势，在16:00时降至最低。两种烟草的最低值分别为662.667、526.333，日均值分别为825、723.523，转基因烟草的Fm高于野生烟草。图8、图9

图8 Fo日变化
Fig.8 Diurnal variation of Fo

图9 Fm日变化
Fig.9 Diurnal variation of Fm

2.3.2 Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII日变化

两种烟草的Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII均呈现先下降后上升的日变化趋势，在16:00时降至最低。Fv/Fm最低值分别为0.732、0.531，日均值分别为0.821、0.736；Fv/Fo最低值分别2.739、1.135，日均值分别为5.044、3.391；ΦPSII最低值分别为0.563、0.239，日均值分别为0.763、0.600，转基因烟草的Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII均高于野生烟草。图10～12

图10 Fv/Fm日变化
Fig.10 Diurnal variation of Fv/Fm

图11 Fv/Fo日变化
Fig.11 Diurnal variation of Fv/Fo

图12 ΦPSII日变化
Fig.12 Diurnal variation of ΦPSII

3 讨论

叶片通过光合作用将光能、CO2、水等转化为具有能量的有机物以满足生长发育需要，是植物体内最基本、最复杂的生理过程[15]。Pn是衡量植物光合作用的主要指标，直接反映植物叶片光合能力强弱；Gs是指植物气孔与外界交换气体，调控水分消耗能力；植物胞间CO2是植物光合作用过程中碳源的主要来源[23]。Gs的大小、Ci的高低直接影响植物净光合速率[24,25]。研究表明，多数植物在夏季高温时会出现光合“午休”现象[9,22,24-26]。Farquhar等[27]针对这一现象提出，若Pn、Gs、Ci同时降低，“午休”现象主要由气孔限制因素造成；若Pn、Gs同时降低，Ci上升，“午休”现象主要由非气孔限制因素造成。试验发现转基因烟草和野生烟草的Pn、Gs日变化均呈“双峰”曲线，在午间高温强光时段两者均出现主要由非气孔限制因素导致的光合“午休”现象，这与胡亚杰[9]的研究一致。进一步分析发现，相比野生烟草而言，转基因烟草的Pn、Gs较高，Tr、Ci较低，这与刘卫群等[21]、胡亚杰[9]等的研究结果有所差异，他们的试验结果显示转BnDREB1-5基因烟草的Pn、Gs、Tr、Ci均小于野生烟草。

植物在午间高温强光时段，叶片光合机构往往不能完全利用它所吸收的光能，造成光合效率下降，此类现象被称为光抑制，光抑制是非气孔限制因素的主要形式[28]。叶绿素荧光动力学技术能够有效地探测植物光合反应中心的运行状态[16,26-27]，Fo的变化是判断PSII反应中心是否受破坏或失活的直接证据，Fo上升可能是由于植物叶片PSII反应中心受到破坏或失活；Fo下降可能由于植物叶片通过增加PSⅡ天线的热耗散，来消耗掉未被利用的光能以保护光合反应中心不受影响[16,26,28,30]。Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII降低通常是判断植物在逆境胁迫下遭受光抑制的显著特征，可作为反映胁迫程度的理想指标[28-32]。试验发现，Fo日变化呈现先上升后下降趋势，Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII日变化呈现先下降后上升趋势，均在16:00时到达峰值或谷值，表明两种烟草在逆境条件下均受到光抑制，PSII反应中心捕获光能效率降低，出现可逆失活，并未遭到破坏，这与胡亚杰[9]、钟敏等[26]、刘卫群等[23]、赵跃锋等[31]的研究结果一致。进一步分析发现，转基因烟草Fo的上升幅度及Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII的下降幅度都小于野生烟草，表明转基因烟草的PSII反应中心相对稳定；Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSII较高，转基因烟草能将吸收的光能更有效地利用到光合作用中，这与刘卫群等[23]研究一致。

4 结 论

烟草受到高温强光的影响，叶片光合反应中心出现可逆失活，造成由光抑制的非气孔限制因素迫使烟草净光合速率下降。与野生烟草相比，转AcCBF1基因烟草同化CO2能力较高，光合能力较强，光合反应中心较稳定，对高温的适应能力较强。扁桃AcCBF1基因能够有效改善烟草的光合作用，维护光合反应中心的稳定；通过选育逆境下扁桃AcCBF1高表达品种来应对夏季的干旱高温。