乳腺癌生存期相关长非编码MAPT-AS1及其共表达基因筛选与验证

许家瑞，刘冬冬，李贝贝，陈梦麟，汪 湾，黄凯铃，郑周霞，徐建华

（1.广州中医药大学第二附属医院//广东省中医院检验医学部，广东 广州 510120；2.广州万德基因医学科技有限公司，广东 广州 510535；3.广州中医药大学顺德医院，广东 佛山 528000）

乳腺癌是女性中最常见的一种恶性肿瘤，据美国癌症协会统计，乳腺癌发病率一直居女性各类恶性癌症之首，且呈逐年上升趋势，其死亡人数也在不断增加［1-3］，尽管手术、放化疗等治疗使乳腺癌患者的长期生存率有所提高，但乳腺癌患者的死亡率仍在升高。早期乳腺癌不具备典型症状和体征，不易引起病人重视，往往容易漏诊。因此，早期诊断乳腺癌对乳腺癌的治疗具有重要意义。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，越来越多的特异性分子靶点被发现。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类不能编码蛋白质的RNA分子，转录本长度超过200个核苷酸。lncRNA曾被认为不具有生物学功能，然而越来越多的研究发现，lncRNA能在基因组印记、染色质修饰与重塑、转录激活与干扰和核内运输等生物学进程发挥重要调控作用［4］，并在各类癌症中起着重要的调节作用［5］。目前已有研究发现乳腺癌发生发展过程中，存在lncRNA表达的异常改变，提示lncRNA可作为乳腺癌潜在诊断标志物，这对乳腺癌药物选择以及治疗方法的寻找等方面具有重要意义［6-7］。本研究旨在发现乳腺癌生存期相关特异性表达lncRNA及其共表达基因，并通过构建真核表达载体，使其在乳腺癌细胞T47D中稳定过表达和干扰，为进一步研究长非编码MAPT-AS1在乳腺癌发生发展中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

人乳腺癌细胞株T47D由广州医科大学附属肿瘤医院研究所邓敏教授实验室馈赠。RPMI1640培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；胎牛血清购自Invitrogen公司；嘌呤霉素Puromycin购自Invivogen公司；逆转录试剂盒购自TAKARA公司；2X PowerUp SYBR Green Master Mix购自Thermo公司；PCR引物由上海生工生物设计合成；过表达、干扰及对照质粒pCDH-CMV-MCSEF1-copGFP、pLent-U6-GFP-puro购自美国 Vigene公司。Opti-MEM、转染试剂LipofactamineTM2000购自Invitrogen公司；质粒提取试剂盒购自Biomiga公司。

1.2 数据库筛选差异表达lncRNA与共表达基因

课题组从癌症基因图谱（The Cancer GenomeAtlas，TCGA）下载乳腺癌数据，包括转录组数据（RNA-seq）和临床生存数据；经单因素COX和Log Rank分析找到与生存期相关的lncRNA。通过lncRNA相关性分析，得到正相关的调控基因用于实验验证。引物设计见表1。

表1lncRNA-MAPT-AS1及其靶基因引物序列Table 1 lncRNA-MAPT-AS1 and its target gene primer sequences

1.3 细胞转染以及稳转细胞株的筛选

用含体积分数10%的胎牛血清的RPMI1640完全培养基于37℃、体积分数5%的CO2恒温培养箱中常规培养乳腺癌细胞T47D；当细胞处于对数生长期时用胰酶消化制成单细胞悬液，按2 mL/孔将细胞铺于6孔板中，实验分为阴性对照（negative control，NC）组，转染过表达空质粒Empty vector和干扰空质粒shRNA-NC）组，过表达组（转染重组过表达质粒MAPT-AS1 vector）和4个干扰组（转染shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4干扰质粒）。质粒（2 μg）与转染试剂LipofactamineTM2 000（5 μL）进行转染，并验证转染效率（质粒带绿色荧光），转染后用最佳浓度嘌呤霉素（0.5 μg/mL）进行筛选，连续培养1周，进行传代直至获得稳定细胞株，此后用含0.5 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基维持培养。

1.4 验证稳定转染细胞株内lncRNA-MAPT-AS1及其靶基因的表达水平

收集7组筛选后的稳转乳腺癌细胞，用Trizol分别提取总RNA，按逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA，然后以此cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为20 μL，反应条件设置如表2。经罗氏Light Cycler 480荧光定量PCR仪检测，以 GAPDH 为内参，采用 2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。每组样品重复3次，试验重复3次。实验工作经伦理委员会批准。

1.5 统计学方法

数据分析采用Graph Pad Prism 5软件统计分析并作图，计量资料采用均数±标准差（）表示，RNA-seq数据分析使用单因素COX和Log Rank分析，各组之间比较用单因素方差分析，P值均为双边检验，以P＜0.05为差异有统计学意义的检验标准。

2 结果

2.1 乳腺癌差异表达lncRNA与共表达基因筛选

我们分析了943例RNA-seq数据信息：（837例乳腺癌患者+106例正常对照），经单因素COX和Log Rank分析找到与生存期相关的lncRNA，找到了显著性最高的长非编码MAPT-AS1；发现长非编码MAPT-AS1高表达，预测乳腺癌患者生存期更长（图1A）。通过lncRNA相关性分析，找出正相关的调控基因共14个（表3）。选择相关性最高的前5个基因（图1B-F）用于实验验证。

表3MAPT-AS1正相关调控基因Table 3 MAPT-AS1 positive correlation regulatory genes

图1MAPT-AS1与共表达基因Fig.1 MAPT-AS1 and co-expressed genes

2.2 转染效率验证及长非编码MAPT-AS1干扰片段筛选

转染效率如图2所示，可见转染效率达90%以上，以此条件继续后续实验。转染过表达长非编码MAPT-AS1的稳转细胞株内长非编码MAPT-AS1的相对表达水平上升，差异有统计学意义（P＜0.001；图2C），表明筛选的细胞株为稳定过表达长非编码MAPT-AS1的乳腺癌细胞株T47D。转染不同干扰片段后长非编码MAPT-AS1的相对表达水平下降，差异有统计学意义（P值均＜0.05；图2D），结果显示shRNA3干扰效果最好。

2.3 稳定转染细胞株内长非编码MAPT-AS1共表达基因的表达水平

本研究选取预测结果中表达量最高的5个共表达基因：MAPT（microtubule associated protein tau）、MAPT-IT1（MAPT intronic transcript 1）、SPPL2C（signal peptide peptidase like 2C）、KDM4B（lysine demethylase 4B）、NXNL2（nucleoredoxin like 2）进行验证，在乳腺癌细胞T47D中预先转染MAPTAS1干扰片段shRNA3和干扰对照shRNA-NC，再进行RT-qPCR实验验证。结果显示：MAPT、MAPT-IT1和NXNL2在转染了shRNA3干扰片段后相对表达量降低，差异有统计学意义（P值均＜0.05，图3），与长非编码MAPT-AS1的表达趋势一致，SPPL2C未见表达。

图2 乳腺癌细胞株T47D转染长非编码MAPT-AS1效率验证及其过表达和干扰的相对表达量Fig.2 Efficiency verification and overexpression and interference relative expression of breast cancer cell line T47D transfected with lncRNA-MAPT-AS1

图3 长非编码MAPT-AS1共表达基因表达水平Fig.3 lncRNA-MAPT-AS1 co-expression gene expression level

3 讨论

本研究通过TCGA数据库筛选乳腺癌患者差异表达lncRNA，经单因素COX和Log Rank分析找到与生存期相关的lncRNA，发现了显著性最高的长非编码MAPT-AS1。通过LncRNA相关性分析，找出正相关的调控基因，选择相关性最高的前5个基因进行实验验证。荧光显微镜可见转染效率达90%以上，RT-qPCR验证，成功构建长非编码MAPT-AS1过表达及干扰稳定转染乳腺癌细胞株T47D，并筛选出干扰效率最高的长非编码MAPTAS1干扰片段sh-RNA3。RT-qPCR验证长非编码MAPT-AS1共表达基因，得到MAPT、MAPT-IT1和NXNL2在转染了shRNA3干扰片段后表达量降低，与长非编码MAPT-AS1的表达趋势一致，结果显示，长非编码MAPT-AS1在乳腺癌患者中高表达，可能具有致癌作用。

近年来，研究者发现MAPT表达增加可能与帕金森病（PD）疾病状态有关，而MAPT-AS1和DNA甲基转移酶（DNMT）为MAPT的潜在表观遗传调节因子［8］；MAPT-AS1、SPPL2C、MAPT、MAPTIT1、CRHR1、MGC57346、CRHR1-IT1、STH和KANSL1这些基因中的一个或多个的单倍不足可能是导致Koolen de Vries综合征（KDVS；MIM 610443）表型的原因［9］。MAPT-AS1过表达可部分保护MAPT不被降解，而MAPT-AS1敲低可降低MAPT的表达，同时也降低了MAPT的稳定性。研究发现MAPT-AS1在年龄较小（＜60），肿瘤较大（≥2 cm），转移淋巴结和分期（Ⅲ-Ⅳ）的ER阴性患者中表达较高，并与细胞生长、侵袭性和紫杉醇抗性相关，可作为ER阴性乳腺癌的潜在治疗靶点［10］。MAPT变体可能与家族性和散发性肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶变性（FTLD）的发生相关［11］。系统性硬化症（SSc）相关性间质性肺病（ILD）与特发性间质性肺炎（IIP）中肺部受累的表型相似，预测用力肺活量百分比（FVC%）与SPP2C中的SNP rs2076295、rs17690703和MAP19中的rs1981997相关［12］。KDM4B在TGF-β诱导的胰腺癌上皮-间质转化（EMT）过程中表观遗传地调节ZEB1的表达，是EMT过程中的关键介质。在胰腺癌患者的肿瘤组织中，KDM4B的蛋白水平与ZEB1呈正相关，可作为人胰腺癌转移进展的重要预后标志物和治疗靶点［13］。

研究发现MAPT-AS1及其共表达基因MAPT、MAPT-IT1、SPPL2C、KDM4B、NXNL2在许多疾病的发生发展中均具有一定意义，但他们在乳腺癌分子水平上的作用机制研究仍不明确，进一步研究和证实他们在乳腺癌中的功能机制，或许能成为乳腺癌诊断治疗、生存预后的重要新靶点。