血管内皮生长因子C和皮层肌动蛋白在食管鳞癌细胞中的表达及其临床意义

杨 阳，李校天，张九娜，周丽云，郭永泽

0 引 言

食管癌为常见的消化道恶性肿瘤之一，随着科学诊疗技术的发展，食管癌的靶向治疗成为新的研究热点，但尚未有大型的专门针对食管鳞癌靶向治疗的相关研究［1］。研究发现，血管内皮生长因子C（Vascular endothelial growth factor C，VEGFC）的表达在食管鳞癌组织中明显高于食管正常黏膜组织［2］；皮层肌动蛋白（Cortactin，CTTN）在多种不同来源的肿瘤细胞中存在过表达现象且其与食管鳞癌的临床分级密切相关［3-6］。更有研究报道VEGFC、CTTN两分子与促进食管癌生长及淋巴转移密切相关，且两分子之间可能存在一定的相关性，但其具体分子机制及其作用关系尚未明确［7-9］。据统计学资料显示，我国临床上确诊的食管癌病例中以食管鳞癌较为多见，而大多数食管鳞癌患者在产生临床症状及就诊之前往往早已发生淋巴转移，故早期发现并控制疾病发展是治疗的关键［10-11］。因此，本研究通过体外分别干扰人食管鳞癌TE1细胞中VEGFC、CTTN的基因表达，探讨两因子对食管鳞癌细胞增殖及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1主要实验仪器及试剂人食管鳞癌TE1细胞株（河北医科大学第二附属医院实验室惠赠），RPMI Medium1640培养基（Solarbio），胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），VEGFCsiRNA、CTTNsiRNA、阴性对照RNA、阳性对照RNA、siRNA-MATETM转染试剂（苏州吉玛基因股份有限公司），CCK-8试剂盒（Solarbio）、流式细胞凋亡检测试剂盒（Solarbio）、TRIzolTM试剂（艾德莱生物），Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂（TAKARA公司，日本）。

1.2实验分组实验根据添加不同试剂分为：空白组（单纯培养细胞）、MATE转染试剂组（添加MATE试剂）、阴性对照组（添加阴性对照RNA及MATE试剂）、阳性对照组（添加阳性对照RNA及MATE试剂）、VEGFCsiRNA转染组（添加VEGFCsiRNA及MATE试剂）、CTTNsiRNA转染组（添加CTTNsiRNA及MATE试剂）。各转染基因序列依次为：阴性对照RNA sencine5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′antisencine5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；阳 性 对 照 RNA sencine5′-UGACCUCAACUACAUGGUUTT-3′antisencine5′-AACCAUGUAGUUGAGGUCATT-3′；VEGFCsiRNAsencine5′-CACCUUCUUUAAACCUCCATT-3′antisencine5′-UGGAGGUUUAAAGAAGGUGTT-3′；CTTNsiRNA sencine5′-CCAUGGCUAUGGAGGGAAATT-3′antisencine5′-UUUCCCUCCAUAGCCAUGGTT-3′。

1.3转染转染前24h将细胞接种在96孔板中，以转染时细胞的汇合度在30%～45%为宜。转染前，取125µLDEPC水于1OD的siRNA干粉管中稀释至20µmol/L。取 0.2µL的上述siRNA溶液加入到50µL无血清1640中，轻轻混匀。加入1µL的siRNA-MATE，加入后立即充分混匀（可用振荡器振荡10 s以上），室温放置10 min（保证足够时间静置，且孵育时间≤30min），形成siRNA-siRNA-MATE复合物。在复合物孵育的10min内，从细胞培养板中移除原有的培养基。每孔加入100µL预热的完全培养基（含10%血清和抗生素）。将siRNA-siRNAMATE复合物50µL滴加到包含细胞和培养基的孔中并轻晃摇匀。将培养板放置于37℃，CO2培养箱孵育24h。

1.4细胞总RNA提取取对数生长期食管鳞癌细胞接种于6孔板，按上述分组干预24h后，弃去培养基，用TRIzol收集细胞提取总RNA。分光光度计检测RNA的浓度和纯度，A260/A280为1.8～2.0时表明提取的RNA纯度较高，可用于荧光定量检测。

1.5逆转录反应分别于冰上配置逆转录反应液，加入上述提取的RNA溶液共200ng，Olig（dT）18试剂0.5µL，Random primer试剂 0.5µL，并加入 RNase free ddH2O最终配成共12µL的反应液，于70℃下作用10min后迅速将其冷却1min；然后依次加入10mmol/L的dNTP Mixture试剂0.5µL、RNase inhibitor（40U/µL）试 剂 0.25µL、5xM-MLV buffer试 剂4.0µL、RTase M-MLV（RNase H-）试剂 0.5µL，加入ddH2O使其最终达到20µL，将溶液混匀后于42℃恒温下作用60min，再于72℃灭活15min，最后于-20℃保存备用。该步骤及所需试剂均参考Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）逆转录试剂说明书进行。

1.6 RT-PCR反应提前设计所需的特异性的正反向引物，具体引物序列依次为：GAPDHrRNA（内参）Forward5′-TCCACTGGCGTCTTCACCACCAT-3′Reverse5′-GGAGGCATTGCTGATGATCTTGAGG-3′；VEGFC Forward5′-TTGCCAATCACACTTCCTGCC-3′Reverse5′-TCTTGTTCGCTGCCTGACACT-3′；CTTN Forward5′-CAGGCCGACCGAGTAGACAAGA-3′Reverse5′-CGATACCGTATTTGCCGCCGAA-3′。具体配置反应液步骤依次为：正向引物、反向引物各 0.5µL，AceQTMqPCR SYBR® Green Master Mix 10uL，cDNA 2uL（cDNA 稀释 10倍），ddH2O 7µL。将配好的液体放置于RT-PCR仪上并使用ViiA7TMSystem software软件设定反应程序，设定反应条件依次为：首先95oC 1min；其次95oC 10s，59oC 20s（此步骤收集荧光信号），该步骤共进行45个循环；再于60oC～95oC进行溶解曲线分析。采用Applied Biosystems ViiA 7TMReal-Time PCR System检测各个基因的Ct值，所有反应均设3个复孔。根据Comparative Delta-delta Ct法△△Ct=（Ct基因-Ct内参基因）-（Ct基因-Ct内参基因）对照组，利用2-△△CT计算各个基因相对于对照组的表达量。

1.7 CCK8检测细胞增殖情况细胞接种于96孔板，待细胞长至30%～45%时，按上述步骤进行分组干预，每组设4个复孔。干预24h后，每孔加入10µL CCK-8，于培养箱内孵育约1h，使用酶标仪测定450nm波长处吸光度值（A值）。细胞存活率计算公式如下：

1.8流式细胞仪检测细胞凋亡情况取对数生长期食管鳞癌细胞接种于6孔板，按上述分组干预24h后，弃去培养基，胰蛋白酶消化细胞，以1mL1xBinding Buffer悬浮细胞，4℃ 1200转/min离心5min，弃上清，PBS洗2次，1mL 1xBinding Buffer结合缓冲液重悬细胞后，细胞密度为1×106个/mL，每管取出100uL液体（细胞密度1×105个/mL）分别加入5µL AnnexinV-FITC混匀后室温避光孵育10min，加入5µL PI室温避光孵育5min，再于每管加入400µL PBS至500µL液体后，轻柔涡旋混匀，于1h内上流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

1.9统计学分析采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。实验数据以均数和标准差（xˉ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 VEGFCmRNA及CTTNmRNA的相对表达量的比较VEGFCsiRNA转染组VEGFC mRNA表达量、CTTNsiRNA转染组CTTN mRNA表达量较空白组明显降低（P＜0.05）。证明转染成功。见表1。

表1 各组VEGFC及CTTNmRNA相对表达量的比较（）Table 1 Relative expressions of VEGFC and CTTN mRNA in different groups of the ESCC cells（xˉ±s）

表1 各组VEGFC及CTTNmRNA相对表达量的比较（）Table 1 Relative expressions of VEGFC and CTTN mRNA in different groups of the ESCC cells（xˉ±s）

与空白组比较，*P＜0.05

组别空白组MATE转染组阴性对照组阳性对照组VEGFCsiRNA转染组CTTNsiRNA转染组CTTNmRNA相对表达量1.00±0.00 1.05±0.08 0.98±0.08 1.00±0.02 0.97±0.03 0.29±0.02*VEGFCmRNA相对表达量1.00±0.00 0.94±0.01 0.93±0.01 0.97±0.04 0.13±0.01*0.96±0.01

2.2各组食管鳞癌细胞增殖率VEGFCsiRNA转染组及CTTNsiRNA转染组细胞增殖率较其他组均明显降低（P＜0.05），VEGFCsiRNA转染组细胞增殖率较CTTNsiRNA转染组明显降低（P＜0.05）。见表2。

2.3流式细胞仪检测食管鳞癌细胞凋亡率VEGFCsiRNA转染组、CTTNsiRNA转染组细胞凋亡率均较其他组明显增高（P＜0.05），VEGFCsiRNA转染组细胞凋亡率较CTTNsiRNA转染组明显增高（P＜0.05）。见表2。

表2 食管鳞癌细胞增殖率及凋亡率实验结果（xˉ±s，%）Table 2 Proliferation and apoptosis of the ESCC cells in different groups（xˉ±s，%）

3 讨 论

食管癌为我国十大恶性肿瘤之一，据统计我国以食管鳞状细胞癌为主要病理组织类型［12-13］。VEGF又称血管内皮生长因子，其中VEGFC是VEGF家族中最强的促淋巴管生成因子［14-15］，它能够调节细胞生物学行为及细胞恶变的发生［16］。CTTN常被称为皮层肌动蛋白，该基因是位于染色体11q13区上的癌基因［17］，既往研究证实CTTN是肿瘤细胞侵袭性伪足的主要功能蛋白［18］。研究显示VEGFC、CTTN与多种肿瘤致病相关［19-22］，更有学者认为两分子与食管鳞癌的癌细胞转移及生存活力密切相关［23］。因此本实验对VEGFC、CTTN在食管鳞癌中的表达及其临床意义进行探讨。

为进一步证实VEGFC、CTTN在食管鳞癌中的表达情况及其相关作用关系，本研究前期通过免疫组织化学等实验方法，证实了VEGFC、CTTN在食管鳞癌组织中成高表达，食管鳞癌的浸润深度、TNM分期、淋巴结转移及淋巴管浸润与食管鳞癌组织中VEGFC、CTTN的表达密切相关等［24］。该结论为本实验细胞学研究提供了强有力的理论支撑，在此基础之上，本实验参照既往shRNA干扰沉默ERCC1对A549/DDP细胞增殖与凋亡的成功案例［25］，并通过对siRNA干扰食管鳞癌细胞目的基因表达技术知识［26］，开展了siRNA基因干扰技术，在肯定了既往研究结果的基础之上，新技术的开展也为本课题的研究开创了新的思路与方法。

本实验主要是对食管鳞癌细胞研究，通过RTPCR对各实验组VEGFC、CTTN的相对mRNA表达量的检测，充分证实了VEGFCsiRNA及CTTNsiRNA转染成功，并肯定了siRNA技术干扰食管鳞癌细胞目的基因表达的可行性。通过对各组CCK8结果及流式细胞仪检测结果的对比分析证实了成功干扰食管鳞癌细胞VEGFC、CTTN表达后均可抑制食管鳞癌细胞增殖并促进其凋亡，并通过对结果的分析对比明确了干扰VEGFC的表达对食管鳞癌细胞增殖、凋亡的影响作用大于CTTN。因此本实验结果充分肯定了VEGFC、CTTN与食管鳞癌细胞生长密切相关等实验结论。

综上所述，本实验从细胞分子学角度入手，通过成功实施细胞学基因干扰技术证实了分别干扰VEGFC、CTTN表达均可抑制食管鳞癌细胞增殖并促进其凋亡，且VEGFC较CTTN对食管鳞癌的生长及凋亡影响作用更为显著等结论，为下一步明确两基因促进食管鳞癌淋巴浸润的分子机制奠定了基础。