湘西山莓叶挥发油化学成分及其抗氧化、抑菌活性研究

中南林业科技大学材料科学与工程学院，湖南 长沙 41000

山莓(RubuscorchorifoliusL.f.)，又名三月泡，系蔷薇科Rosaceae，蔷薇亚科悬钩子属RubusL.中的一种落叶灌木[1-2]。山莓根、茎、叶、果实均可入药。根性味微苦、辛、平，具有活血化瘀、祛风除湿、解毒敛疮的功效，主治痢疾、遗精、湿疹、毒蛇咬伤、闭经痛经、风湿腰痛、小儿疳积等症[3-4]，未成熟果实性味微甘、酸、温，具有化痰解郁、醒酒止渴、涩精益肾、助阳明目之功效，常用于替代覆盆子入药做引[5-6]，主治肾虚、遗精、醉酒、丹毒等症。叶性微苦，具有解毒、消肿、敛疮、清热利咽等作用，主治咽喉肿痛、多发性脓肿、乳腺炎等症[7]。在湖南湘西山莓作为苗族药治疗腹泻，疗效确切[8]。目前湘西山莓叶及其挥发油的化学成分及抑菌活性虽见报道[9-10]，但考虑到生态环境的多样性，意味着二次代谢产物的多样性，本实验对湘西张家界山莓叶提取挥发油，GC-MS鉴定化学成分, DPPH法评价自由基清除能力[11-12]，刃天青96孔板微量稀释法测定抑菌活性[13]，试图更详细探明山莓叶挥发油其医药和保健作用的内在本质，以期更好地综合开发利用湘西山莓资源，提供重要的参考依据。

1 材料

山莓叶采自吉首大学张家界校区后山，由吉首大学廖博儒教授鉴定为蔷薇科悬钩子属植物山莓R.corchorifoius的叶,阴干,粉碎后备用石油醚(沸程30～60 ℃)、无水硫酸钠、氯化钠、蒸馏水、DPPH自由基、无水乙醇、VC、芦丁、卡拉霉素、刃天青(Resazurin)、甲醇以上试剂均为分析纯Thermo DSQ-II GC-MS联用仪(美国赛默飞科技公司)、紫外分光光度计、Multiskan FC酶标仪(美国赛默飞科技公司)、pH酸度计(HM-205日本TOA公司)、烘箱(DN-63日本yamato公司)、培养箱(PW/10-002 重庆实验设备厂)、超净工作台(CCV-1311日本日立公司)、冰箱、高压蒸汽灭菌器(SM-52、日本)1/万天平(AEG-220日本岛津)、水蒸气蒸馏装置、电子天平、真空干燥箱、旋转蒸发仪、真空干燥器、FD-1冷冻干燥机。

2 方法

2.1 山莓叶挥发油的提取 称取600.00 g山莓叶粉于挥发油提取器中，加3000 mL蒸馏水加热提取，收集蒸出液，再加入NaCl 直至蒸出液饱和，然后用30～60 ℃的石油醚萃取，无水硫酸钠脱水，石油醚萃取液于37 ℃旋转蒸发仪减压浓缩，即得山莓叶挥发油。

2.2 GC-MS检测条件 色谱条件：石英毛细管柱BP×5(25 m×0·22 mm×0·25 μm)；起始温度40 ℃,保持3 min, 以5.0 ℃/min的升温速率升到220 ℃，保持5 min；进样温度230 ℃,分流比30∶1, 进样量1 μL,载气为氦气,流速为1.0 mL/min;质谱条件:离子源EI, 离子源温度250 ℃,电子能量 70 eV,发射电流: 120 μA,扫描范围30～500 amu。定性分析: Mainlib谱库检索,确定成分,峰面积归一化法确定相对含量。

2.3 山莓叶挥发油清除DPPH自由基 准确称取12.5 mg DPPH·无水乙醇溶解定容, 配制成50 μg/mL储备液(现用现配)，即为标准储备液。分别取0、2、4、6、8 mL标准储备液在25 mL容量瓶中定容，标准溶液浓度依次为：0、4、8、12、16 μg/mL。在517 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

称取0.2325 g山莓叶挥发油于25 mL容量瓶中，无水乙醇溶解定容，再分别取0、0.1、0.25、0.5、1 mL于10 mL容量瓶中与5 mL浓度为40 μg/mL的DPPH标准液混合，乙醇定容，山莓叶挥发油浓度依次为0、93、232.5、460、930 μg/mL。517 nm处动态测定吸光度，根据标准曲线得到DPPH·残留量。绘制不同浓度的挥发油与DPPH混合物中DPPH残留率的变化曲线。

DPPH·残留率=[DPPH·]T/[DPPH·]T0×100%

式中：[DPPH·]T为某一时刻DPPH·的质浓度；[DPPH·]T0为DPPH·的起始质量浓度。

各自称取5.00 mg芦丁、Vc于分别100 mL容量瓶，无水乙醇定容，即得芦丁、Vc储备液。分别取0、0.5、1、1.5、2.0、2.5 mL储备液于10 mL容量瓶，与5 mL浓度为40 μg/mL的DPPH标准液混合，乙醇定容，即分别得芦丁、Vc系列溶液为0、2.5、5、7.5、10、12.5 μg/mL，摇匀。在517 nm处的吸光度，绘制不同浓度的Vc、芦丁与DPPH混合物中DPPH残留率的变化曲线。

2.4 刃天青显色法检测山莓叶挥发油抑菌活性 菌悬液的制作：各细菌株在实验室活化后继代培养，并于冰箱内4℃下保存一部分。用之前先将各细菌株在NA培养基上活化，且以MHB继代培养菌株2～3代，并在试验的前一天继代培养一次，以保证菌的生长能力达到最佳。用分光光度计测定每株细菌菌液的OD600(大肠杆菌在OD600=0.1时的菌浓约为108 CFU /mL，其他细菌参照此数值)。用MHB培养基将菌液稀释到1×108 CFU/mL的浓度。取5 mL菌液和7.5 mL的刃天青指示剂储备液混匀 ，用排枪吸取100 μL菌液加入96孔板，除无菌对照孔外。

供测试样品和阳性对照的储液的配制：将挥发油于-10 ℃条件下静置24 h，冷冻分层，分离上下层。 用乙醇将挥发油、冷冻后挥发油的上下层及标准品配制成最大浓度为1.00 mg/mL的储液，然后以倍比稀释，共配制1.00～1.95 μg/mL十个浓度储备液。将上述储备液加入96孔板，每孔2 μL；留无菌对照孔和生长对照孔。

刃天青指示剂配制成750 μg/mL储备液，分别取取5 mLMHB培养基和7.5 mL的刃天青指示剂储备液混匀 ，用排枪吸取100 μL加入96孔板的无菌对照孔。

最低抑菌浓度(MIC)的测定：将96孔板置于37 ℃恒温培养。每5～6小时观察一次，有细菌生长的孔逐渐由蓝色变粉，其中无菌的阴性对照孔为蓝色，细菌阳性对照空为亮红色，以发生颜色变化的前一孔为最低抑菌浓度(MIC)值。

3 结果与分析

3.1 山莓叶挥发油的提取 水蒸气蒸馏法提取山莓叶得到挥发油0.2325 g，山莓叶挥发油的得率为0.03875%。

3.2 山莓叶挥发油化学成分分析 山莓叶挥发油总离子流图如图1所示，其组成成分及相对含量见表1。由表1可知，确定了其中的19种成分，占总挥发油总量的98.49%，其中主要成分为4-甲基-2,5-二叔丁基苯酚(45.46%)，2,3-二甲基戊烷(19.79%)，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(18.09%)，2,5-十八碳二炔酸甲酯(2.54%)紫苏醛(1.66%)等。

表1山莓叶挥发油化学成分分析

3.3 山莓叶挥发油DPPH法抗氧化活性 分光光度法测定DPPH标准系列溶液在517 nm处的吸光值，结果见图2，作线性回归分析，得到线性回归方程为y=0.0351x+0.0445，相关系数R2=0.9991，表明DPPH自由基浓度与其吸光度呈即显著正相关关系。

山莓叶挥发油、Vc和芦丁对DPPH自由基均有清除能力，随着样品浓度的增加，清除效果越好,而且山莓叶挥发油和Vc的清除速度比芦丁要快，如图3、图4、图5所示, 当DPPH·自由基残留率为50%时，山莓叶挥发油浓度为121.9 μg/mL 、Vc浓度为4.8 μg/mL、芦丁为6.3259 μg/mL，由此可知山莓叶挥发油对DPPH自由基的清除能力明显低于Vc和芦丁，山莓叶挥发油对DPPH抗氧化活性相对较弱。

3.4 山莓挥发油抑菌活性 刃天青显色抑菌活性测试结果见表2，表明山莓叶挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、沙门氏菌、苏云金杆菌均有一定的抑菌作用，而且对痢疾志贺杆菌的最低抑菌浓度(MIC)达到31.25 μg/mL。挥发油冷冻下层对痢疾志贺氏杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为15.6 μg/mL，低于卡拉霉素标准品。

表2 刃天青显色法抑菌实验结果 (MIC，μg/mL)

4 讨论

通过GC-MS技术对湘西张家界山莓叶挥发油的化学成分进行鉴定分析，可知其主要成分为酚类及其含氧衍生物(63.55%)，烷烃类(19.79%)，酯类(2.54%)醛类(1.66%)等，比较周双德测定的山莓叶挥发油的主要成分烷类(62.71%)、酯类(7.57%)、酚类(2.6%)、醇类(2.17%)，程怡测定的主要成分烷类(37.4%)、醇类(16.33%)、酯类(6.52%)、酚类(2.6%)、测定成分及含量均存在差异，有待进一步研究。DPPH法结果表明湘西山莓挥发油抗氧化能力相对弱于芦丁和Vc。 此外，刃天青96孔板微量稀释显色法与K-B纸片法相比较，分析方法灵敏，结果稳定，需要的试剂和样品量少，适合植物提取分离所得少量样品的抑菌活性筛选，在实验中发现山莓叶挥发油对痢疾志贺杆菌的最低抑菌浓度达到15.6 μg/mL，比卡拉霉素标准品抑菌效果更好，是一种潜在的抗菌药源，有待进一步研究开发。综上所述山莓叶挥发油具有一定的抗氧化和良好的抑菌能力，作为天然抑菌剂和抗氧化剂具有良好的开发前景，同时也为湘西山莓开发利用提供理论依据。