柴胡-黄芩药对的不同分离部位对H2O2刺激肝星状细胞增殖的影响

1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000;2.陕西省交通医院，陕西 西安 710000

肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质(特别是胶原物质)的过度沉积[1]，是各种病因引起的肝脏损伤后的一种损伤修复反应，其中肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)的活化是关键，因为肝脏受损后HSC活化是细胞外基质的主要来源。氧化应激是造成HSC活化增殖的重要因素，研究表明氧化应激相关分子过氧化氢(H2O2)能够刺激HSC活化增殖，改变细胞外基质的沉降[2-3]。

随着肝组织的持续损伤，增生的纤维组织逐步取代正常的肝组织，最终发展成为肝硬化，其在全球呈现出高发病率以及高死亡率[4]。肝纤维化是各种慢性肝病发展成为肝硬化的一个中间环节。肝纤维化属于可逆性病变[5]，若在临床早期采取抗肝纤维化治疗，将对慢性肝病的治疗以及阻止肝硬化的发生会产生非常积极的作用。目前，在抗肝纤维化方面中医药表现出独特的疗效，而且多是采用舒肝理气、活血类中药，其对于多种慢性肝病的治疗具有积极意义[6]。课题组前期研究表明，柴胡-黄芩配伍水煎液对大鼠肝纤维化模型具有良好的保护作用[7]，但对于柴胡-黄芩药对抗肝纤维化的药效物质基础尚未见报道，故本实验在建立体外H2O2刺激HSC活化增殖的基础上，观察柴胡-黄芩药对不同分离部位的抗肝纤维化作用，以期寻找柴胡-黄芩药对抗肝纤维化主要药效物质基础，为进一步研究抗肝纤维化药物开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试药 中药材柴胡和黄芩均购自陕西中医药大学校医院中药房，经陕西中医药大学生药教研室教师鉴定为正品，符合2015版《中华人民共和国药典》规定标准。

1.2 细胞 大鼠肝星状细胞株HSC-T6，购自灏洋生物公司。

1.3 试剂与材料 胎牛血清(批号：FB-10，美国KIRGEN公司)；DMEM-H(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶(批号：1939066)、青链霉素双抗(批号：1924794)美国Gibco公司；透明质酸酶试剂盒(hy-aluronidase，HA，批号:201805)、层黏连蛋白试剂盒(laminin，LN，批号:201805)、Ⅲ型前胶原试剂盒(procollagen Ⅲ，PCⅢ，批号:201805)、Ⅳ型胶原试剂盒(collagen type Ⅳ，Ⅳ-C，批号:201805)购自上海优选生物科技有限公司；MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-四氮唑溴盐)(批号：EZ2811B347，美国Sigma公司)；乙醇为分析纯(天津市天力化学试剂有限公司)；D101大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公司)；30%H2O2(天津北联精细化学品开发有限公司)。

1.4 仪器 CO2培养箱(新加坡ESCO)；倒置显微镜(奥特 BDS200)；酶标仪(美国Bio Tek ELx808)；离心机(湘仪 L530)；双人型超净工作台(新加坡 ESCO)；旋转蒸发器RE-52A(上海亚荣生化仪器厂)。

1.5 方法

1.5.1 柴胡-黄芩水提液的制备 参照文献及课题组前期实验结果[8]，柴胡饮片50 g、黄芩饮片25 g，共75 g，加入8倍量水浸泡30 min，煎煮，并保持沸腾30 min；过滤，再加入8倍量水煎煮30 min。过滤，合并两次滤液混匀浓缩至150 mL，即得浓度为0.5 g/mL的柴胡-黄芩水提液。将得到的柴胡-黄芩水提液平均分成两份，一份用于分离制备不同部位，一份进行干燥得干粉用于后续体外实验。

1.5.2 柴胡-黄芩不同分离部位的制备 参照文献方法制备柴胡-黄芩不同分离部位[9-11]，将上述0.5 g/mL的柴胡-黄芩水提液上D101大孔吸附树脂柱，径高比为1∶10以上，依次用水和30%，60%，90%乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，得到水和30%，60%，90%乙醇洗脱4个不同极性部位，即水洗脱部位(A)、30%乙醇洗脱部位(B)、60%乙醇洗脱部位(C)、90%乙醇洗脱部位(D)，分别干燥得干燥粉末。

1.5.3 大鼠HSC的培养 将大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)于DMEM高糖培养基(含10%的胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素)，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养并传代。取对数生长的HSC，以5×104(个)/mL浓度接种到96孔培养板中过夜。

1.5.4 H2O2刺激HSC增殖模型的建立 参照文献方法建立H2O2刺激的HSC增殖模型[2-3]。将30%H2O2用无血清培养基进行稀释，分别配制成为终浓度为0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L的H2O2溶液。加入到细胞贴壁后的96孔板中，每个浓度分别设6个复孔。培养24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，置培养箱继续培养4 h后，吸净孔内培养基，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，酶标仪单波长检测OD值。按下列公式计算细胞存活率。

细胞存活率%=(试验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.5.5 药物处理 实验分组如下:对照组(无药物处理)，H2O2模型组(5 μmol/L H2O2作用24 h)，给药组(5 μmol/L H2O2作用24 h后，再用柴胡-黄芩及A、B、C、D高中低剂量作用24 h)。

1.5.6 柴胡-黄芩及其不同分离部位对H2O2刺激的HSC增殖的影响 各组培养24 h后，加入5 mg/mL MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，吸弃孔内培养液，每孔加入DMSO 150 μL，低速震荡10 min，以充分溶解被还原的MTT结晶，酶标仪单波长检测OD值。

1.5.7 柴胡-黄芩及其不同分离部位对H2O2刺激的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影响 各组培养24 h后，收集细胞上清液，参照试剂盒使用说明书，应用ELISA法检测HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量。

2 结果

2.1 H2O2刺激HSC增殖模型的建立 在H2O2浓度0～5 μmol/L范围内时，H2O2对HSC具有活化促增殖作用，且具有一定的剂量相关性；在H2O2浓度为5 μmol/L时对HSC具有明显的活化促增殖作用(P<0.01)；在H2O2浓度大于5 μmol/L时，随着浓度的不断增大，H2O2对HSC的激活作用逐渐减弱，且在H2O2浓度为20μmol/L时HSC的存活率仅50%左右，H2O2对HSC表现为显著的抑制作用(P<0.01)。综上所述，本课题组选用5μmol/L H2O2作用24 h作为HSC的增殖模型。如图1所示。

2.2 柴胡-黄芩及其不同分离部位对H2O2刺激的HSC增殖的影响 与对照组比较，H2O2干预后，能够显著促进 HSC的增殖(P<0.01)；与H2O2组相比，柴胡-黄芩组(高、中剂量组)、A组(高剂量组)、B组(高、中剂量组)、C组(高、中剂量组)及D组(高剂量组)对H2O2诱导的HSC增殖均具有一定的抑制作用，其中柴胡-黄芩高剂量组及B组高剂量组、C组高剂量组对H2O2诱导的HSC增殖具有尤其明显的抑制作用(P<0.01)。见表1。

表1 柴胡-黄芩及其不同分离部位对H2O2刺激的HSC增殖的影响

注：与H2O2组相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 柴胡-黄芩及其不同分离部位对H2O2刺激的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影响 与对照组比较，H2O2作用于HSC后，HSC分泌的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量明显升高；与H2O2组比较，柴胡-黄芩组及A组、B组、C组、D组可以明显降低H2O2诱导的HSC细胞分泌的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量，其中柴胡-黄芩组高剂量组、A组高剂量组及B组高剂量组对其作用最为明显(P<0.01)。见表2。

表2 柴胡-黄芩及其不同分离部位对H2O2刺激的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影响

注：与H2O2组相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

HSC的激活过程是肝脏胶原产生和肝纤维化形成的重要环节。在一系列刺激因素的作用下，HSC被活化转变为肌成纤维细胞，细胞大量增殖，合成细胞外基质，在肝脏内大量沉积，造成肝纤维化。氧化应激在HSC的活化和细胞外基质生成中具有重要作用，H2O2是氧化应激的相关分子，多项研究发现H2O2能够刺激HSC活化和细胞外基质的生成[2-3]。

肝纤维化是慢性肝病发展成肝硬化的必经阶段。现研究认为肝纤维化是一个动态过程，属于可逆性病变[5]，而肝硬化则是一种不可逆性病变。因此，抗肝纤维化则成为治疗慢性肝病以及预防肝硬化的重要目标。源自汉代张仲景的小柴胡汤是临床治疗肝病的常用方剂，具有确切的抗肝纤维化疗效[12-14]，柴胡-黄芩是小柴胡汤的核心药对。本课题组前期以小柴胡汤中的核心药对柴胡-黄芩的抗肝纤维化作用为切入点，研究发现其水提液具有确切抗肝纤维化作用[7]。为了进一步探究柴胡-黄芩药对抗肝纤维化的药效物质基础，筛选出其发挥抗肝纤维化作用的有效部位，故本实验在建立体外H2O2刺激HSC活化增殖的基础上，观察柴胡-黄芩药对不同分离部位的抗肝纤维化作用。

实验结果显示，与对照组相比，HSC经H2O2刺激后，大量增殖，其细胞培养液中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量显著增加。由此可见，H2O2对于HSC具有一定的激活促增殖作用，使肝纤维化相关因子HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C分泌显著增加，显现出肝纤维化倾向。给予柴胡-黄芩药对及其不同分离部位的高、中、低剂量干预后，各给药组中的HSC的增殖均受到抑制，HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量也有所降低，其中柴胡-黄芩及B、C高剂量组中的HSC受到的抑制作用最为明显，具有一定的剂量相关性，差异有统计学意义(P<0.01)。

综上所述，柴胡-黄芩药对及其B、C部位对H2O2刺激的肝星状细胞增殖具有一定的抑制作用，B、C可能是柴胡-黄芩抗肝纤维化的主要有效部位。据文献报道柴胡中主要含多糖、皂苷、挥发油、黄酮、甾醇类等成分[15]，黄芩中主要含黄酮、萜类、苷类、挥发油等成分[16]。根据各成分的性质推测B、C中可能含有的成分为皂苷、黄酮苷类等成分，但其具体成分有待进一步研究。单味中药本身所含成分复杂多样，药对及复方甚之，且中医复方讲求整体性以及多种成分之间的相互关系，两味中药共同煎煮会出现怎样的成分变化，以及不同分离部位进行重新配伍组合以后会出现怎样的现象，有待进一步的研究，以期为抗肝纤维化中药研发提供实验依据。