一测多评法测定降脂宁颗粒中的3种有机酸类成分含量

贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550004

降脂宁颗粒最早收载于吉林省药品标准(1986年版)，原名“血脂宁冲剂”。处方由山楂(去核)、制何首乌、决明子、荷叶4味药材组成，具有降血脂、软化血管的作用。从国家食品药品监督管理总局数据库中查询到，目前其执行标准共11份，尚未对方中君药山楂进行含量控制，而山楂质量的优劣直接影响降脂宁颗粒的药效。山楂的化学成分主要包括黄酮及黄酮苷类、有机酸类、黄烷类及其聚合物等，有机酸类是山楂健胃消食的有效成分[1-7]。研究选取山楂中的有机酸类成分新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸作为指标性成分进行含量测定。

复方中药制剂中药效的发挥是多组分共同作用的结果，其成分具有多样性、复杂性特点。因此，中药制剂较单味药材更需要强调其多成分、多靶点特征。为了更好的控制降脂宁颗粒中山楂的含量，实验采用多指标质量控制的“一测多评”方法首次对降脂宁颗粒山楂含量进行全面的控制，通过对一个对照品易得成分的测定，实现多个成分的同步监控，本文以绿原酸为内参物，采用高效液相色谱法测3个有机酸类成分含量，改善目前中检院尚无新绿原酸、隐绿原酸等对照品供应情况，尤其是完善了现行质量标准中无君药山楂含量控制问题[8-15]。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Ultimate 3000液相色谱仪及配套工作站(PDA检测器，赛默飞世尔科技有限公司)；色谱柱：依利特 ODS2 C18，(4.6mm×250mm,5.0 μm)；Agilent ZORBAX SB C18，(4.6 mm×250 mm,5.0 μm)；Waters X-bridge C18，(4.6 mm×250 mm,5.0 μm)；百万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料 新绿原酸(批号：MUST-15011413，成都曼斯特生物科技有限公司，含量：93.37%)、绿原酸(批号：110753-201415，中国食品药品检定研究院，含量：96.2%)、隐绿原酸(批号：MUST-15011413，成都曼斯特生物科技有限公司，含量：99.07%)；降脂宁颗粒(生产企业：A公司，批号：a-1，a-2，a-3，a-4，a-5，a-6，a-7，a-8，a-9，a-10)。色谱乙腈(美国TEDIA，LOT 17080656)、甲醇(国药集团化学试剂有限公司，10014118)，超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，按下表1规定进行梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸检测波长为326 nm；理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于10000。图谱见图1。

2.2 混合对照品溶液的制备 称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品适量，置量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1 mL分别含35 μg、45 μg、34 μg溶液，摇匀，作为混合对照品储备液。精密量上述对照品储备液1 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品混合溶液。

表1 流动相梯度洗脱比例

2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约3 g，精密称定，置具塞锥瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，称定重量，超声(功率250 w，频率100 kHz)处理45 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品的制备 取不含山楂药材的样品，按照降脂宁颗粒配方(删除山楂药材)，模拟工艺制备阴性样品，照供试品溶液制备项下方法制得阴性样品溶液。

2.5 方法考察

2.5.1 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下对照品溶液，进样量分别为2、3、5、10、15 μL分别注入液相色谱仪，以峰面积A对质量数μg进行线性回归计算，得到绿原酸的线性回归方程为：y=32060x+69.71，r=0.9996，线性范围0.0090 μg～0.0672 μg；隐绿原酸线性回归方程为：y=2335x+94.32，r=0.9993，线性范围0.0066 μg～0.03867 μg；新绿原酸线性回归方程为：y=3455x+45.28，r=0.9991，线性范围0.0077～0.0525 μg；结果表明3种成分线性范围内关系良好。

2.5.2 精密度试验 精密量取“2.2”项下对照品溶液的制备项下的混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录色谱图，其RSD值分别为新绿原酸1.7%、绿原酸0.6%、隐绿原酸1.5%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验 取同一批(批号：a-1)的样品，按“2.1”项下含量测定方法，重复测定6次，记录色谱图，以绿原酸为S峰，其余2个成分的实际保留时间均在以S峰与相对保留时间所计算的时间范围内，故可通过校正因子计算出新绿原酸、隐绿原酸的含量，其RSD值分别为1.6%、1.0%、2.4%，表明方法重复性良好。结果见表2。

表2 重复性试验

2.5.4 稳定性试验 取同一批(批号：a-1)的样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0，24，48 h进样，记录色谱图，测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量，其RSD值分别0.8%、1.9%、1.7%，结果表明48 h内供试品溶液是稳定的。

2.5.5 准确度 采用加样回收法，取已知含量的样品(批号：a-1 平均含量：含新绿原酸0.0182 mg/g、绿原酸0.5767 mg/g、隐绿原酸0.0224 mg/g)6份，每份1.5 g，精密加入对照品溶液(含新绿原酸：0.02559 mg/mL、绿原酸：0.1743 mg/mL、隐绿原酸：0.01988 mg/mL)1mL置具塞锥瓶中，挥干，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，以绿原酸为S峰，其余2个成分的实际保留时间均在以S峰与相对保留时间所计算的时间范围内，故可通过校正因子计算出新绿原酸、隐绿原酸的回收率，结果新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸平均加样回收率RSD分别为1.7%、1.1%、1.0%。表明本方法具有良好的回收率。结果见表3。

表3 回收率试验

2.6 相对校正因子(fsi)和相对保留时间(t)的确定

2.6.1 校正因子的计算方法 多标多测的研究思路起源于内标法、校正因子法、主成分自身对照法以及紫外百分吸收系数法等几个概念。计算公式：fsi=fi/fs=(As/Cs)/(Ai/Ci)=(As·Ci)/(Ai·Cs)，式中As为内参物峰面积，Ai为其他组分峰面积，Cs内参物浓度，Ci为其他组分浓度。在方法学建立时，需要准备待测组分及所选内参物的对照品，求出内参物与个待测组分见的校正因子，并把它作为常数用于以后的含量测定计算中。含量测定过程中，只需准备内参物的对照品，因而内参物(s)浓度可按常规方法进行测定，应用校正因子，结合内参物实测值计算待测组分浓度(Ci)。

2.6.2 待测成分fsi和t的计算 取“2.2”项下的混合对照品溶液进样，测定峰面积，以绿原酸为参照，以其相应的峰为S1峰，计算各待测成分与绿原酸之间的fsi与t，结果相对保留时间及相对校正因子见下表4。

表4 相对校正因子及相对保留时间

2.7fsi耐用性考察

2.7.1 不同色谱柱对fsi和t的影响 采用高效液相色谱系统分别对三种品牌(依利特 ODS2、Agilent ZORBAX SB、waters X-bridge)的C18色谱柱分别进行测定，考察不同色谱柱对fsi和t的影响，记录色谱图，计算校正因子，RSD应小于5.0%，结果见表5。

表5 色谱柱对fsi的影响

2.7.2 不同柱温柱对fsi和t的影响 采用高效液相色谱系统，以柱温20、30、40 ℃分别进行测定，考察不同柱温对fsi和t的影响，记录色谱图，计算校正因子，RSD应小于5.0%，结果见表6。

表6 柱温对fsi的影响

2.7.3 不同体积流量对fsi和t的影响 采用高效液相色谱系统，分别考察了流速为0.8、1.0、1.2 mL·min-1体积流量对fsi和t的影响，记录色谱图，计算校正因子，RSD应小于5.0%，结果见表7。

表7 体积流量对fsi的影响

2.7.4 不同人员对fsi和t的影响 采用高效液相色谱系统，考察人员对fsi和t的影响，精密吸取三位不同人员所配制的混合对照品溶液(见表8)，分别进行测定，记录色谱图，计算校正因子和相对保留时间，RSD应小于5.0%，结果见表9。

表8 对照品的浓度

表9 人员对fsi的影响

2.7.5 不同仪器对fsi和t的影响 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液10 μL，分别采用Ultimate 3000，waters 2998不同厂牌高效液相色谱仪分别进行测定，记录色谱图，计算校正因子和相对保留时间，RSD应小于5.0%，结果见表10。

2.8 一测多评法与外标法测定结果的比较 取10批降脂宁颗粒样品按“2.3”项下制备供试品溶液，分别采用一测多评法和外标一点法对其进行定量计算，见表11。结果表明，常规的外标一点法测法实测量本实验所建立的一测多评计算所得量，结果差异不大，证明本实验所建立的方法具有较好的准确性和可行性，所得结果可靠。

表10 仪器对fsi的影响

表11 外标法与一测多评结果对比

3 讨论

对于供试品制备方法的考察，实验从提取方法(超声和回流)、提取溶剂(20%甲醇，50%甲醇，80%甲醇，甲醇)以及提取时间(15 min，30 min，45 min)对降脂宁颗粒的提取效果进行了比较，结果表明，采用50%甲醇超声提取45 min，3种有效成分的量较高，且色谱峰的分离效果最佳。

山楂有机酸类成分主要有熊果酸、枸橼酸、绿原酸等，实验设计初期，希望统一色谱条件下测定熊果酸、枸橼酸、绿原酸三个有效成分，熊果酸极性与枸橼酸和绿原酸相差较大，在一个色谱条件下，无法实现三者的共同测定。另据文献报道[16]熊果酸不溶于水，而降脂宁颗粒中山楂工艺为用水煎煮，样品中枸橼酸峰达不到较好的分离效果，基于此考虑选取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对山楂进行评价。据报道[17]，绿原酸在酸性pH条件下十分稳定，在中性和碱性pH条件及加热情况下，绿原酸很容易水解并生成新绿原酸、隐绿原酸，因此采用一测多评测定三个成分的含量，以总量计评价降脂宁颗粒，更加合理。同时，通过中国食品药品检验研究院网站查询，中检院暂无新绿原酸、隐绿原酸对照品销售，故选择常见的绿原酸作为山楂有机酸检测的内参物，用以测定有机酸类中新绿原酸与隐绿原酸的含量。

本实验建立的绿原酸与其他2种有效成分的校正因子，并考察了不同规格色谱柱、柱温、体积流量、人员、仪器对校正因子和相对保留时间的影响，结果RSD均<5%，表明各成分的相对保留因子重复性好。实验中还采用外标外与一测多评法测定10批样品指标性成分含量进行比较，结果2种方法所测值无明显差异，说明该方法的建立基本达到节省对照品，以多指标控制药品质量的目的。