灵芝养肝丸的质量标准研究

1.山东省莱芜市食品药品检验检测中心，山东 莱芜 271100；2.五矿集团鲁中矿业有限公司职工医院，山东 莱芜 271100

灵芝养肝丸为莱芜市中医医院制剂品种，具有疏肝利胆、行气化湿的功效，适用于脂肪肝、乙肝、胆系感染等症。灵芝养肝丸由17味药组成，组方复杂，原批准的质量标准较简单，达不到控制质量的目的。为了更好的控制药品质量，增加了对组方中猪苓、大黄、赤芍、黄连、厚朴、甘草的显微鉴别，大黄、黄连的薄层色谱鉴别和高效液相色谱法测定赤芍中芍药苷的含量，从而较全面的反应包括投料在内的质量控制指标。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Shimadzu LC-20A高效液相色谱处理系统(日本)；梅特勒-托利多XS105DU电子分析天平(瑞士)；科哲生化薄层色谱成像系统；KQ-250DE超声波清洗器；BX-51奥林巴斯显微镜。

1.2 材料 灵芝养肝丸(批号：180524、180607、180620，莱芜市中医医院)；大黄(批号：120902-201311)；黄连(批号：120913-201611)；芍药苷(批号：110736-201842)对照药材与对照品均为中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 显微情况 取本品适量，用水溶散，取沉淀物共装10个载玻片置显微镜下观察：菌丝散在或黏结成团，无色或淡棕色，细长，稍弯曲，有分枝(灵芝)。菌丝间有草酸钙方晶，大多呈正方八面体形等(猪苓)。草酸钙簇晶大，直径60～140 μm(大黄)。导管群放射状排列，导管旁有木纤维(赤芍)。石细胞鲜黄色，单个或成群散在(黄连)。石细胞分支状，壁厚，层纹明显(厚朴)。纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维(甘草)。如图1～7所示。

2.2 薄层鉴别

2.2.1 大黄的TLC鉴别 取本品0.6 g,加甲醇20 mL，浸渍1 h，滤过，取滤液5 mL，蒸干，残渣加水5 mL溶解，再加盐酸0.5 mL，置水浴上加热30 min，立即冷却，用乙醚20 mL，分2次(10 mL、10 mL)振摇提取，合并乙醚提取液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。再取大黄对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。另取处方中除去大黄的其他药味，按处方比例制成缺大黄的阴性对照样品。取阴性对照样品2 g，同供试品溶液的制法，制成阴性对照溶液。分别取上述3种溶液各4 μL，分别点在硅胶G薄层板上，石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的5个橙色荧光斑点；置氨蒸气中熏后，日光下检视，显相同的红色斑点。阴性对照在相应位置没有斑点，表明阴性对照无干扰。如图8～9所示。

2.2.2 黄连的TLC鉴别 本品1 g剪碎，加甲醇5 mL，超声处理15 min，滤过，滤液作为供试品溶液。再取黄连对照药材0.25 g，同法制成对照药材溶液。另取处方中除去黄连的其他药味，按处方比例制成缺黄连的阴性对照样品。取阴性对照样品2 g,同供试品溶液的制法，制成阴性对照溶液。分别取上述三种溶液各2 μL。分别点在硅胶G薄层板上，甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水(6∶3∶1.5∶2∶0.3)为展开剂，在另槽中加入等体积的浓氨试液，预平衡15 min，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照在相应位置没有斑点，表明阴性对照无干扰。如图10所示。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱的条件 C18色谱柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)；速度：1.0 mL/min；检测波长：230 nm；进样量：10 μL。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。

2.3.2 制备对照品溶液 取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。

2.3.3 制备供试品溶液 取本品10丸，剪碎，称取5 g，精密称定，加入等量硅藻土，研细，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)30 min，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 制备阴性对照溶液 按处方比例制成不加赤芍药材的阴性样品，按照供试品溶液方法2.3.3制成阴性对照溶液。

2.4 方法学的考察

2.4.1 线性范围 分别精密吸取浓度为0.06 mg/mL的芍药苷溶液各2、5、10、15、20、30 μL，注入液相色谱仪，分别测定峰面积积分值。以对照品的进样量为横坐标，对照品峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程:y=88224x- 8993.3，相关系数r=0.9999。试验结果表明，芍药苷进样量在0.06～1.8 μg之间进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.4.2 仪器精密度试验 精密吸取芍药苷对照品溶液(0.06 mg/mL)5 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测其峰面积积分值。结果RSD为0.19%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 样品稳定性试验 取样品(180524)照上述方法实验。每隔5 h进样1次，每次5 μL，测定芍药苷的峰面积积分值，共5次，结果RSD为0.50%，表明供试品溶液在25 h内稳定性良好。

2.4.4 方法重复性考察 取同一批号(批号：180607)的样品6份，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进行测定，计算含量与RSD，结果表明，灵芝养肝丸供试品中芍药苷的含量为0.93 mg/g。RSD为1.89%，表明含量测定方法的重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 取已测知含量的本品适量(批号：180607，芍药苷的含量为0.93 mg/g)，剪碎，取约2.5g，精密称定，加入等量硅藻土，研细，置具塞锥形瓶中，精密加入芍药苷对照品溶液(浓度为：0.06 mg/ml)40 mL、甲醇10 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)30 min，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，计算。结果表明，测定方法的回收率良好。见表1。

表1 加样回收率考察结果

2.4.6 专属性试验 将对照品溶液、样品溶液及阴性对照溶液，依次进行测定，按照“2.3.1”设定的色谱条件进行实验。图谱表明：阴性对照无相应色谱峰，可认为在此方法下该样品中其他组成部分对实验没有影响。结果如图11～13所示。

2.5 样品测定 取3批样品，按“2.3.3”项下方法得到的样品溶液，按照预设的条件进行实验，根据所得的峰面积得到样品中芍药苷的含量。结果见表2。

表2 芍药苷含量测定结果

3 讨论

实验参考药典方法[1]，分别采用显微鉴别法对猪苓、大黄、赤芍、黄连、厚朴、甘草进行鉴别，各品种特征明显可见。用高效液相色谱法测定赤芍中芍药苷的含量，参考相关文献[6-9]，采用高效液相色谱法测定了赤芍中芍药苷的含量。考察了安捷伦 1200、岛津 LC-20A两种仪器和Inertsil ODS-3(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；Agilent 5 TC-C18(4.6 mm × 150 mm，5 m)；Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)3种色谱柱的影响。两种仪器和上述3种柱子由计算所得可知实验耐用性满足要求，该方法操作简便，样品中芍药苷峰与杂质峰完全分离，分析时间短，重现性良好。

根据相关资料[2-5]，进行大黄、黄连的薄层色谱法适用性试验，考察了不同的温湿度(16℃、26℃，32%、65%、88%)和薄层板(Merck、青岛海洋、烟台大学科工所、自制板)，均得到了满意结果。该方法适用于灵芝养肝丸的测定。